細胞培養(yǎng)基的幾個問題

 

 

L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？

L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

 

GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定？

GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

 

什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？

酚紅在培養(yǎng)基中用作PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

 

如何用臺盼蘭計數(shù)活細胞？

用無血清培養(yǎng)基把細胞懸液稀釋到200～2000個/毫升，在0.1毫升細胞懸液中加0.1毫升0.4％的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計數(shù)板計數(shù)細胞。活細胞排斥臺盼蘭，因而染成藍色細胞是死細胞。

 

培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？

丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

 

二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？

二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。

 

室溫下配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用時PH值是多少？

緩沖液PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時，不同PH值。 50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時，不同PH值 4°C 25°C 37°C 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 8.9 9.0 9.1 9.2 9.3 9.4 8.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5

 

如何從T25瓶中轉(zhuǎn)移sf9細胞？能用胰蛋白酶消化嗎？

我們推薦使用脫落細胞的方法，此技術(shù)破壞性最小，生活力最高。通過使用巴斯德吸液管，讓細胞上培養(yǎng)基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。只有在絕對必要的情況下，才使用胰酶消化細胞。 胰酶消化一個T25瓶的sf9細胞：

1.       去除培養(yǎng)基。

2. 用2ml 1xPBS（足以覆蓋細胞表面）洗滌細胞，去除PBS。

3. 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆蓋細胞表面）。

4. 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。

5. 向細胞中加入2ml 細胞培養(yǎng)液，移入錐形管，用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養(yǎng)基中的FBS終止了胰酶的活性。）

6. 離心（1100rpm）沉淀細胞。去除培養(yǎng)基。

7. 用新的培養(yǎng)基重新懸浮細胞。傳代。

 

在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養(yǎng)時，肝素的使用量是多少？

為了防止懸浮培養(yǎng)細胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。

 

在重新凍存sf9細胞前，它可以傳多少代？

隨著傳代的次數(shù)的增加，它的感染能力會降低嗎？ 通常情況當(dāng)細胞經(jīng)過30次傳代后，應(yīng)該返回凍存。無論什么時候計數(shù)時，都應(yīng)該檢查細胞活力。如果超過95％的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍，細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降，它們的感染力將不在是有效的。

 

貯存在冰箱中的瓶口已開的培養(yǎng)基，在放置幾天后顏色變紫?

這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時，碳酸氫納導(dǎo)致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口，在CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)基10-15分鐘，來校正溶液的pH值（確定松開瓶口以保證氣體交換）。

 

細胞培養(yǎng)基偶然被凍，可否繼續(xù)使用？

如果細胞培養(yǎng)基偶然被凍，您應(yīng)該熔化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒有沉淀產(chǎn)生，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。 無血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)使用的抗生素量一樣嗎？ 當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結(jié)合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對于細胞達到毒性水平。 培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎？ 一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

 

培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復(fù)凍融嗎？

大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。

 

為什么要在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液?

胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩(wěn)定。 保存血清最好的方法? 我們建議血清應(yīng)保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃時，請勿超過一個月。若一次無法用完一瓶，建議無菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇�容器�?nèi)，再放回冷凍。

 

如何解凍血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損?

將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規(guī)則地搖晃均勻。

 

血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理?

血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。 若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。最好不使用過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞過濾膜。 為什么要熱滅活血清? 加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng)ES細胞、平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。

 

有必要做熱滅活嗎?

實驗顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)的細胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進，或完全沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量，而造成細胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。 若非必須，可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時間，更確保血清的質(zhì)量!

 

為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現(xiàn)沉淀?

有些胎牛血清產(chǎn)品沒有預(yù)老化，儲存在2－8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應(yīng)該不會影響血清的質(zhì)量。推薦在－20℃儲存胎牛血清，避免反復(fù)凍融。

 

如何避免沉淀物的產(chǎn)生?

我們建議您在使用血清的時候，注意下列的操作: (1)解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，非常容易產(chǎn)生沉淀物。 (2)解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。 (3)請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。 (4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。 (5)若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。