郝麟1） 朱平1）＊ 于曉梅2） 張大成2） 趙新生3） 歐陽(yáng)賤華3

（1）北京大學(xué)第一醫(yī)院 北京 100034； 2）北京大學(xué)微電子學(xué)研究所 北京100871； 3）北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院 北京100871）

目的:
我們?cè)O(shè)計(jì)一種含有大量微反應(yīng)池的PCR基因芯片，能對(duì)基因的重排，突變和缺失等基因變異進(jìn)行檢測(cè)。PCR基因芯片的關(guān)鍵問(wèn)題是如何檢測(cè)出來(lái)在微反應(yīng)池內(nèi)獲得的極其微量PCR產(chǎn)物。本文應(yīng)用一些臨床病例的實(shí)例標(biāo)本，觀察能否在基因芯片上進(jìn)行不同的熒光摻入PCR反應(yīng)并根據(jù)基因芯片上熒光的變化判斷基因的變異。

方法：制作以硅片為材料的PCR基因芯片。利用健康外周血，正常臍血DNA，X連鎖遺傳性鐵粒幼細(xì)胞貧（XLSA）家系成員6人外周血DNA做PCR-SSCP，并測(cè)序確定。設(shè)計(jì)檢測(cè)此點(diǎn)突變的Taqman探針進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，在芯片上進(jìn)行同樣的反應(yīng)，與上述反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行對(duì)照。利用4步位點(diǎn)特異PCR結(jié)合SYBR熒光染料初篩HLAA2，并在芯片上進(jìn)行同樣的反應(yīng)，與上述反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行對(duì)照。

結(jié)果：設(shè)計(jì)并制作了有192個(gè)微反應(yīng)池以硅片為材料的PCR基因芯片。PCR-SSCP分析與測(cè)序確定X連鎖遺傳性鐵幼粒細(xì)胞貧血家系兩患者的ALAS2基因第5外顯子有G514A點(diǎn)突變，母親、外祖母為雜合子攜帶者。設(shè)計(jì)Taqman探針對(duì)此家系中六位成員DNA與二份正常男性臍血DNA檢測(cè)與預(yù)期結(jié)果相符。將上述結(jié)果中同樣的樣本移入芯片進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果與常規(guī)熒光PCR反應(yīng)的結(jié)果一致。SYBR熒光染料PCR反應(yīng)與芯片上SYBR熒光染料PCR反應(yīng)的結(jié)果與預(yù)期完全相符。

結(jié)論：利用TaqMan探針與SYBR
Green熒光染料可以在PCR基因芯片上順利進(jìn)行PCR反應(yīng)，根據(jù)基因芯片上熒光的變化檢測(cè)出點(diǎn)突變與單核苷酸多態(tài)性。為基因芯片的臨床應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： PCR基因芯片；熒光PCR反應(yīng)；Taqman探針；熒光染料；

基因芯片技術(shù)具有快速多樣、微型化和自動(dòng)化[1～4]等特點(diǎn)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛的應(yīng)用。但由于其基本原理是基于核酸雜交技術(shù)，有著內(nèi)在的缺陷[5-6]，實(shí)驗(yàn)的敏感性和重復(fù)性都存在一定問(wèn)題。核酸雜交較適合于檢測(cè)基因的表達(dá)，不易檢測(cè)基因組DNA的基因的重排，突變和缺失。而大多數(shù)腫瘤性疾病和一些遺傳變異和表型的改變與后者有關(guān)。為了解決上述問(wèn)題，我們將芯片技術(shù)與熒光PCR技術(shù)相結(jié)合，設(shè)立設(shè)計(jì)一種含有大量微反應(yīng)池的PCR基因芯片，以期能快速、準(zhǔn)確的對(duì)基因的重排，突變和缺失等基因變異進(jìn)行檢測(cè)。常規(guī)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)是電泳后觀察獲得基因片段的大小，PCR基因芯片的關(guān)鍵問(wèn)題是如何檢測(cè)出來(lái)在微反應(yīng)池內(nèi)獲得的極其微量PCR產(chǎn)物。本文應(yīng)用一些臨床病例的實(shí)例標(biāo)本，觀察能否在基因芯片上進(jìn)行不同的熒光PCR反應(yīng)，如何根據(jù)基因芯片上熒光的變化判斷基因的變異。

1 病例、材料與方法

1.1 基因組DNA標(biāo)本
健康成年人外周血DNA，正常臍血DNA，X連鎖遺傳性鐵粒幼細(xì)胞貧血（XLSA）家系成員6人外周血DNA均獲自北京大學(xué)第一醫(yī)院，均簽署知情同意書。XLSA家系中患者為兄弟兩個(gè)，年齡分別為8、7歲，都在嬰兒時(shí)即發(fā)現(xiàn)貧血。家中有一個(gè)健康的姐姐，在兩兄弟出生前，母親曾有多次男胎自然流產(chǎn)史。成熟紅細(xì)胞形態(tài)呈典型的小細(xì)胞低色素性貧血，骨髓鐵染色可見大量環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞。臨床初步診斷遺傳性鐵粒幼細(xì)胞貧血。

1.2 PCR基因芯片的設(shè)計(jì)與制作［7］
PCR基因芯片上制備大量微反應(yīng)室，可以同時(shí)進(jìn)行不同的PCR反應(yīng)。采用單拋525mm厚硅片作為襯底材料。硅片常規(guī)清洗后，在10-50°C下生長(zhǎng)800nm厚的濕氧熱氧化層，作為第一層掩膜層。然后150nm厚的Si3N4低壓化學(xué)氣相淀積（LPCVD）在硅片表面，形成第二層掩膜。第一次光刻，RIE刻蝕反應(yīng)室及其流道上的Si3N4；采用掩膜板2光刻反應(yīng)室的圖形，RIE和BHF刻蝕反應(yīng)室表面的SiO2。KOH腐蝕反應(yīng)室的硅至150 um，此時(shí)流道上的硅由于有足夠厚的SiO2作為保護(hù)層，沒有開始腐蝕。腐蝕掉流道上的SiO2，同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)室及流道上繼續(xù)SiO2的腐蝕，KOH腐蝕的速度為1um／min，芯片進(jìn)行熱氧化生長(zhǎng)300 um SiO2，以增強(qiáng)其表面的親水性，保證反應(yīng)液可以在芯片內(nèi)順利流動(dòng)。芯片通過(guò)PVC聚合物壓合封閉。

1.3 PCR基因芯片上應(yīng)用Taqman熒光探針
1.3.1 PCR擴(kuò)增XLSA家系A(chǔ)LAS2基因第五外顯子并且獲得基因片段
經(jīng)www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST查詢ALAS2基因的全長(zhǎng)序列。應(yīng)用Primer3.0軟件設(shè)計(jì)第五外顯子引物：上游引物: 5’-ccataagtcaatgactgagc-3’，下游引物: 5’-aagtggtgatagaacccaag-3’。在94℃ 3分鐘，然后94℃ 30秒、56℃ 30秒、72℃ 1分鐘共30個(gè)循環(huán)，72℃ 延伸5分鐘條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)。取0.5EP管，加入7ulPCR產(chǎn)物及3ulSSCP上樣緩沖液，96℃變性10分鐘。10％SSCP－聚丙酰胺凝膠及銀染色。PCR 產(chǎn)物交上海博亞公司直接測(cè)序。

1.3.2 PCR-SSCP方法分析按照我室常規(guī)進(jìn)行。

1.3.3 Taqman熒光探針 以發(fā)現(xiàn)的ALAS2基因第五外顯子點(diǎn)突變?yōu)橹行脑O(shè)計(jì)，序列如下： 5’ （熒光集團(tuán)）FAM-CAAGATCATAGAGAAGAAAC- TAMRA（淬滅集團(tuán)） 3’，設(shè)計(jì)Taqman熒光PCR反應(yīng)的上下游引物。序列如下：上游引物:5’-tcagttatgaccagtttttcaggg-3’，下游引物:5’-gaacacacggtaggtgtgatcct-3’

1.3.4 常規(guī)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)ALAS2基因第五外顯子基因突變 在GeneAmp ®SDS 5700熒光PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件50℃0C 2分鐘，94℃ 10分鐘，然后94℃ 30秒，60℃ 30秒共40個(gè)循環(huán)

1.3.5 PCR基因芯片上進(jìn)行PCR反應(yīng)
用0.5ml清潔醫(yī)用注射器緩慢吸取Taqman熒光PCR反應(yīng)液。刺破芯片表面PVC封膜，沿加樣孔緩慢將反應(yīng)液加入，用透明膠帶封住加樣孔。將芯片放入Gene Amp PCR System 2400 PCR儀，行PCR反應(yīng)，探索不同反應(yīng)條件。

1.3.6 PCR基因芯片上的PCR產(chǎn)物檢測(cè) 在共焦顯微拉曼光譜儀(Renishaw 1000)上檢測(cè)熒光。將芯片置于顯微鏡的載物臺(tái)上，在普通光源照明下，調(diào)節(jié)載物臺(tái)的垂直位置，使待探測(cè)的芯片上表面位于20X物鏡的焦平面上。再調(diào)節(jié)載物臺(tái)的水平位置，使反應(yīng)池位于目鏡視野的中心。激發(fā)光源為氬離子激光器的488 nm線，檢測(cè)方式是背反式。
1.4 PCR基因芯片上應(yīng)用SYBR Green熒光染料
1.4.1 普通PCR反應(yīng)檢測(cè)20例正常人HLA-A2與非A2 應(yīng)用4步位點(diǎn)特異性PCR反應(yīng)初篩正常人HLAA2與非A2，4步反應(yīng)引物如下(表1)
［8］：PCR反應(yīng)條件按照本室常規(guī)。
表1檢測(cè)HLAA2與非A2 SCP反應(yīng)引物


1.4.2 用SYBR Green熒光染料做常規(guī)實(shí)時(shí)定量PCR 在GeneAmp ®SDS 5700熒光PCR儀檢測(cè)進(jìn)行PCR反應(yīng)初篩HLAA2與非A2，與普通PCR做對(duì)照。SYBR Green熒光PCR反應(yīng)條件: 94℃ 3分鐘，然后94℃ 1分鐘、退火溫度1分鐘、72℃ 1分鐘共30個(gè)循環(huán)，72℃ 延伸5分鐘。第一步反應(yīng)的退火溫度為63℃,第二步、第三步反應(yīng)的退火溫度為65℃、第四步反應(yīng)的退火溫度為64℃。
.1.4.3 PCR芯片上進(jìn)行SYBR Green熒光PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)法同Taqman熒光PCR，探索不同反應(yīng)條件。
.1.4.4 在共焦顯微拉曼光譜儀(Renishaw 1000)上檢測(cè)熒光（方法同上）

2．結(jié)果

2.1 本次試驗(yàn)的PCR基因芯片（21.3 mm ´ 17.5 mm）由192個(gè)微反應(yīng)室組成，可以同時(shí)進(jìn)行192個(gè)不同的PCR反應(yīng)。芯片的長(zhǎng)方體微反應(yīng)室的長(zhǎng)度為700um，寬度為600um，深為200um，體積約為35nl。每?jī)蓚�(gè)微反應(yīng)室之間的間距為1200um。微反應(yīng)室之間由通道相連并匯集形成與外界相通的3個(gè)端口。其中較大的一個(gè)是供加入反應(yīng)液用，其他較小的兩個(gè)是為了能夠排出氣泡與過(guò)量的反應(yīng)液。加樣端口為主流道，又分為很多次流道，每個(gè)微反應(yīng)室的入口與出口就與次通道相連，主流道寬140um；次流道寬50um。微反應(yīng)室與流道腔的深度分別達(dá)到200um與50um。芯片進(jìn)行熱氧化后表面的親水性增強(qiáng)，反應(yīng)液可以在芯片內(nèi)順利流動(dòng)。PVC聚合物壓合封閉芯片，因?yàn)镻CR芯片需要事先在其表面點(diǎn)入若干DNA樣本或引物，封閉材料不僅有良好的導(dǎo)熱性、密閉性、對(duì)PCR反應(yīng)無(wú)抑制且在封閉過(guò)程中不能對(duì)點(diǎn)入的DNA樣本有損。

2.2 PCR-SSCP并測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)X連鎖遺傳性鐵幼粒細(xì)胞貧血家系A(chǔ)LAS2基因第5外顯子基因異常
分析兩兄弟及其父母、外祖父母的ALAS2基因，兩兄弟ALAS2基因第5外顯子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有與正常臍血不同的單鏈電泳條帶，他們的父親和外祖父有與正常臍血相同的單鏈電泳條帶，而他們的母親和外祖母同時(shí)由上述兩種不同的條帶。提示兩患者的ALAS2基因存在異常，這一異�；�因來(lái)自母系。（圖1）測(cè)序表明兩患者的ALAS2第5外顯子有G514A的點(diǎn)突變，母親為雜合子攜帶者。

將DNA序列測(cè)定結(jié)果在互聯(lián)網(wǎng)上(www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)進(jìn)行同源性分析確定兩患者ALAS2第5外顯子G514A點(diǎn)突變。

2.3 常規(guī)實(shí)時(shí)定量PCR在Gene Amp PCR System 2400 PCR儀用Taqman熒光探針能夠檢測(cè)ALAS2基因第五外顯子點(diǎn)突變 在Taqman探針對(duì)此家系中六位成員DNA與二份正常男性臍血DNA分析與預(yù)期結(jié)果完全相符，即：所研究家系中二名患者、外祖母、母親為陽(yáng)性；家系中父親、外祖父以及二份正常男性臍血、陰性對(duì)照均為陰性（圖2）.

2.4 Taqman熒光PCR反應(yīng)能夠在PCR基因芯片上進(jìn)行。

同樣的樣本在PCR基因芯片反應(yīng)，結(jié)果與常規(guī)實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的結(jié)果相符。
即：所研究家系中二名患者（1、2）、外祖母、母親（3、4）為陽(yáng)性；家系中父親、外祖父（5、6）以及一份正常男性臍血（7）均為陰性；0號(hào)為陰性對(duì)照（圖3）。表明Taqman熒光PCR反應(yīng)能夠在PCR基因芯片上順利進(jìn)行


2.5 用SYBR Green熒光染料做常規(guī)實(shí)時(shí)定量PCR分析HLA
應(yīng)用位點(diǎn)特異性PCR(SCP)方法從20例正常人中確定2位HLAA2（編號(hào)1、2）與2位HLA非A2（編號(hào)3、4）。 在GeneAmp ®SDS 5700檢測(cè)SYBR熒光染料4步位點(diǎn)特異PCR反應(yīng)（圖4）SYBR熒光染料PCR反應(yīng)結(jié)果與預(yù)期相符。


2.6 在PCR基因芯片上進(jìn)行SYBR熒光染料PCR反應(yīng)
PCR基因芯片結(jié)果與常規(guī)實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)一致。圖5示第一步SCP反應(yīng)結(jié)果：1號(hào)標(biāo)本為陽(yáng)性，3號(hào)標(biāo)本為陰性，0為陰性對(duì)照.


3．討論

隨著近年基因芯片技術(shù)的發(fā)展，研究者逐漸認(rèn)識(shí)到基于核酸雜交原理的傳統(tǒng)基因芯片缺陷與應(yīng)用的局限性。隨著PCR技術(shù)的進(jìn)展，特別是熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)PCR技術(shù)已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。如果一種基因芯片能直接進(jìn)行PCR反應(yīng),而且能夠同時(shí)擴(kuò)增大批可能發(fā)生變異的基因顯然會(huì)有廣泛的用途。我們與微電子所合作，利用其微加工能力，首次建立含有數(shù)百上千微反應(yīng)池的PCR基因芯片。近年來(lái)熒光PCR方法有所發(fā)展，我們?cè)O(shè)想在如果芯片上設(shè)置多個(gè)微反應(yīng)池進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)芯片上熒光的變化來(lái)確定反應(yīng)結(jié)果，可以免去電泳等繁瑣的檢測(cè)過(guò)程，并且可在不同反應(yīng)池中同時(shí)進(jìn)行多個(gè)反應(yīng)。PCR反應(yīng)在芯片內(nèi)極小容積的微反應(yīng)池中進(jìn)行，每個(gè)微反應(yīng)池均可以將其內(nèi)部的基因擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍，解決了常規(guī)PCR一次僅僅可以分析一種或者少數(shù)幾種基因的不足。微反應(yīng)池內(nèi)的反應(yīng)介質(zhì)的量?jī)H為普通PCR一次反應(yīng)的量，也會(huì)大大節(jié)約試劑開支。

PCR基因芯片的研制面臨重要問(wèn)題是在僅數(shù)十納升的微反應(yīng)池中能否進(jìn)行微量的熒光PCR反應(yīng)？熒光的變化能否準(zhǔn)確檢測(cè)？如何選擇用于不同用途的PCR反應(yīng)類型？

我們利用臨床病例和正常人實(shí)際例證，探討利用Taqman探針和SYBR Green熒光染料在PCR基因芯片上做熒光PCR反應(yīng)的可行性。
TaqMan熒光探針是特異合成的寡核苷酸序列［9］，其5’、3’分別標(biāo)有熒光報(bào)告基團(tuán)（如FAM）、熒光淬滅基團(tuán)（TAMRA）。在PCR擴(kuò)增前，TAMRA通過(guò)Föster能量遷移（FRET）作用，抑制FAM的熒光發(fā)射。如PCR產(chǎn)物中有靶序列存在，則在PCR擴(kuò)增的延伸階段，Taq酶通過(guò)其5’→3’外切酶活性將結(jié)合的TaqMan探針切斷，F(xiàn)AET抑制作用被解除，后者的熒光信號(hào)得以釋放出來(lái)，模板DNA每復(fù)制一次，就有一個(gè)熒光信號(hào)被釋放［10-11］。我們所設(shè)計(jì)的檢測(cè)遺傳性鐵幼粒細(xì)胞貧血家系G514A點(diǎn)突變的探針，結(jié)果證明這類反應(yīng)能在PCR基因芯片上順利反應(yīng)。在結(jié)果圖中可以看出陰性與陽(yáng)性結(jié)果之間差別仍很明顯。但是，TaqMan熒光探針的應(yīng)用仍然存在問(wèn)題，大量合成TaqMan熒光探針會(huì)十分昂貴，平衡大量PCR反應(yīng)的條件也是很困難的事。我們又試用熒光染料SYBR
Green。SYBR Green可以與雙鏈DNA結(jié)合。在PCR過(guò)程中，隨著擴(kuò)增過(guò)程的進(jìn)行，雙鏈PCR產(chǎn)物不斷增多，越來(lái)越多的熒光染料與雙鏈DNA結(jié)合。收集結(jié)合到雙鏈DNA上的SYBR Green熒光信號(hào)就可以直接檢測(cè)各種PCR產(chǎn)物的量。我們用SYBR Green熒光染料和位點(diǎn)特異PCR反應(yīng)檢測(cè)HLAA2與非A2，說(shuō)明這一類型的熒光PCR反應(yīng)能在芯片上應(yīng)用。

TaqMan探針熒光PCR反應(yīng)與SYBR Green熒光染料PCR反應(yīng)各有其優(yōu)缺點(diǎn)。SYBR Green熒光染料主要優(yōu)點(diǎn)是不用針對(duì)每個(gè)PCR反應(yīng)設(shè)計(jì)探針等，缺點(diǎn)是其特異性較差，原因是SYBR Green是非選擇性的與雙鏈DNA結(jié)合。幸運(yùn)的是通過(guò)測(cè)定解離曲線可以排除假陽(yáng)性結(jié)果。用PCR芯片檢測(cè)腫瘤融合基因類型的工作中，如果無(wú)法設(shè)計(jì)數(shù)百個(gè)Taqman探針對(duì)不同的融合基因進(jìn)行檢測(cè)，那么SYBR Green熒光染料PCR反應(yīng)則是很好的選擇。可以事先在芯片上點(diǎn)上檢測(cè)不同融合基因所需要的引物，然后將包括SYBR Green熒光染料的反應(yīng)液加入，檢測(cè)一個(gè)樣本多個(gè)不同融合基因的變化。

我們將芯片技術(shù)與熒光PCR技術(shù)相結(jié)合，利用TaqMan探針與SYBR Green熒光染料檢測(cè)在微反應(yīng)池內(nèi)獲得的極其微量PCR產(chǎn)物。用一些臨床標(biāo)本實(shí)例，觀察在基因芯片上進(jìn)行不同的熒光摻入PCR反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)這些熒光PCR反應(yīng)可以在芯片上順利進(jìn)行，可以根據(jù)基因芯片上熒光的變化判斷基因的變異。為PCR基因芯片的臨床應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。

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(HAO Lin） ZHU Ping1）＊ YU Xiao-Mei2） ZHANG Da-Cheng） ZHAO Xin-Sheng OUYANG
Jian-Hua）

（1）Peking University First Hospital Beijing 100034；
（2）Department of
Microelectronics , Peking University Beijing 100871；
（3）College of Chemistry and Molecular Engineering , Peking University Beijing 100871） Abstract Objectives: To prove if fluorescence PCR which is used for different purposes can be carried through successfully on PCR chips and whether the changes of fluorescence can be detected. To compare the advantages and disadvantages of different methods of fluorescence PCR. Methods: We designed and fabricated a PCR gene chip, which is made of silicon wafer. A point mutation was identified by using SSCP and sequencing a hereditary X chromosome linked sideroblastic anemia family. A Taqman probe specifically to detect this point mutation was designed and used in fluorescence PCR. We carried out the fluorescence PCR on a gene chip and in tubes, and compared the results from the two methods. We also used the 4 steps of site-specific PCR and SYBR fluorescent staining to detect HLA-A2 on the chip and compared the results with that from routine method. Results: A silicon PCR gene chip was designed and fabricated which contains 192 reaction chambers. The point mutation of G514A in the exon 5 of ALAS2 in a hereditary X-linked sideroblastic anemia family was confirmed by PCR-SSCP and seqencing. The results of the 6 members in the anemic family and 2 normal male newborns using Taqman probe we designed and the fluorescence PCR on chip were the same as those form routine method. The results of the routine SYBR fluorescent staining PCR and the reactions on chip were consistent with the expectations. Conclusions: Taqman fluorescence PCR can be carried out successfully on the chip and is suitable for the detection of point mutation and single nucleic polymorphorim. Fluorescence PCR with SYBR fluorescence staining can be performed on the chip and may be useful for the screening of fusion genes in cancer samples.

Keywords: PCR chip; Fluorescence PCR;Taqman probe;SYBR fluorescence staining；