下周四下午三點(diǎn)，陳老濕將在線與大家分享Octet及GlyM糖基化試劑盒在抗體樣品的高通量糖型篩選中的應(yīng)用，掃描上圖右下角二維碼即可報(bào)名參與。

究竟如何在細(xì)胞株構(gòu)建階段就實(shí)現(xiàn)高通量的糖型篩選呢？今天我們就先來一睹為快吧！
 

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單克隆抗體的糖基化位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)[1]

單克隆抗體糖基化修飾多數(shù)為 N-連接的聚糖。IgG抗體一般在Fc段的Asn297有一個(gè)保守的N糖基化位點(diǎn)。其核心結(jié)構(gòu)是由 3 個(gè)甘露糖（Man）和2 個(gè) N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）分子組成的復(fù)雜“雙觸角型”五糖分子的結(jié)構(gòu)，并且不同的糖型可含有不同數(shù)量的其他分子，如巖藻糖（Fuc）、甘露糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖（Gal）、二等分 N-乙酰葡糖胺和唾液酸（Sia）。這些糖鏈的長度、分叉的方式、單糖的排列順序的差異造成了N-聚糖復(fù)雜多變的結(jié)構(gòu)。
 

單克隆抗體常見糖型
 

糖型種類及豐度都可能影響蛋白藥物的有效性、安全性和質(zhì)量穩(wěn)定性。比如唾液酸含量越高，IgG與Fc受體的親和力越低，從而導(dǎo)致ADCC（抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用）活性降低。融合蛋白中唾液酸含量越高，體內(nèi)清除速率越慢。高甘露糖型的單抗分子與 C1q 的親和力較低，其 CDC（補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用） 活性也較低。高甘露糖型結(jié)構(gòu)在人體中容易引起免疫原性。因此糖基化被普遍認(rèn)為是單抗藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）之一。
 

 

上游工藝中的糖型化檢測試劑盒
生產(chǎn)工藝中的細(xì)胞株、培養(yǎng)基、培養(yǎng)工藝都可能影響單抗產(chǎn)品的糖基化修飾水平。目前蛋白糖型的鑒定主要是LS-MS（液相質(zhì)譜）的方法，但是這個(gè)方法不適合粗樣品測試（比如細(xì)胞培養(yǎng)上清），通量也很低。為了解決這個(gè)痛點(diǎn)，賽多利斯專門開發(fā)了基于Octet^®互作儀的糖基化檢測試劑盒，可以在早期階段，比如CLD（細(xì)胞株篩選）的時(shí)候?qū)μ切退�平進(jìn)行高通量檢測。
 

 

分別用Octet的傳感器檢測蛋白濃度（比如用Octet^®蛋白A（ProA）生物傳感器檢測IgG titer），根據(jù)濃度把所有樣品都調(diào)整在某個(gè)濃度下，然后用糖型化檢測試劑盒檢測糖基化水平，并與濃度信息一起分析來選取最佳克隆。

目前，賽多利斯已推出唾液酸（GlyS）檢測試劑盒和甘露糖（GlyM）檢測試劑盒，原理是將能特異性識別某種糖型的凝集素固化在傳感器上，然后與糖基化樣品結(jié)合，再通過信號放大的方法對糖基化水平進(jìn)行排序。

下面分別是兩種試劑盒能夠識別的糖型：
 

甘露糖（GlyM）檢測試劑盒：可以識別高甘露糖型，雜合型和雙觸角復(fù)合型N聚糖
 

唾液酸（GlyS）檢測試劑盒：主要識別末端為唾液酸的糖基

試劑盒使用方法
對于純樣品來說，可以使用“一步法”，即固化了凝集素的傳感器直接與糖基化蛋白反應(yīng)，通過蛋白結(jié)合速率來進(jìn)行排序。而粗樣品或者糖基化水平比較低的純樣品一般需要通過酶底物信號放大。
 
“一步法”對純樣品進(jìn)行糖基化檢測
 

多步法”信號放大，用GlyM傳感器與糖基化樣品孵育，然后用二抗和酶底物進(jìn)行信號放大。

樣品孵育可以離線進(jìn)行，賽多利斯提供Octet® AS離線孵育裝置。
 
左圖是GlyM試劑盒檢測信號放大的原始圖，右圖是信號與甘露糖百分比的相關(guān)性。GlyM檢測信號與甘露糖百分比相關(guān)性高。

方法的優(yōu)勢

1. 通量高，測試速度比較快，如果用8通道的儀器檢測96個(gè)樣品，只需要2個(gè)小時(shí)，而16通道和96通道則分別只需要70分鐘和半個(gè)小時(shí)；
2. 可以直接在粗樣品中對糖基化水平進(jìn)行排序，目前市面上還沒有類似產(chǎn)品；
3. 全自動(dòng)化檢測，重復(fù)性好；

• 對了，其他糖型試劑盒也正在路上...