賽默飛超高靈敏度質(zhì)譜系統(tǒng)助力探索單細(xì)胞蛋白修飾組學(xué)

瀏覽次數(shù)：29　發(fā)布日期：2025-2-21　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

單細(xì)胞組學(xué)

單細(xì)胞組學(xué)研究在揭示細(xì)胞群體異質(zhì)性、發(fā)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞的獨(dú)特性以及識(shí)別所關(guān)注的少數(shù)亞群等方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用，近年來受到越來越多的關(guān)注^[1]。蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的直接執(zhí)行者，由于氨基酸組成的不同、可變剪切以及翻譯后修飾狀態(tài)的不同給蛋白質(zhì)帶來了豐富的多樣性，在蛋白質(zhì)層面對(duì)生理活動(dòng)的多樣性和復(fù)雜性的揭示，逐漸成為探索生命活動(dòng)進(jìn)程的焦點(diǎn)^[2]。近年來，隨著單細(xì)胞RNA測序等技術(shù)的突破，在單細(xì)胞層面深入研究基因組和轉(zhuǎn)錄組成為現(xiàn)實(shí)。高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)不僅揭示了細(xì)胞之間的異質(zhì)性，還保留了傳統(tǒng)群體研究中所發(fā)現(xiàn)的共性問題，這有助于我們更加全面地理解細(xì)胞的功能和調(diào)控機(jī)制^[1]。但由于遺傳物質(zhì)與蛋白表達(dá)含量之間并不是一一對(duì)應(yīng)的定量關(guān)系，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以提供基因表達(dá)的信息，但無法直接推斷出蛋白質(zhì)含量的變化。此外，由于細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯在時(shí)空上的差異性，以及翻譯后修飾對(duì)蛋白質(zhì)調(diào)控等因素，使得對(duì)單細(xì)胞開展蛋白質(zhì)組學(xué)研究成為一個(gè)必要且迫切的需求。單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)能夠提供每個(gè)細(xì)胞中蛋白質(zhì)及其翻譯后修飾的定量信息，為解析生命活動(dòng)在單細(xì)胞層面上的奧秘提供了新途徑和新見解^[3]。

由于單細(xì)胞中所表達(dá)的蛋白含量極低且不同的細(xì)胞之間蛋白表達(dá)量也差異極大，如下圖A所示，單個(gè)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的含量整體在pg-ng級(jí)別，一個(gè)精子中蛋白的總量在18pg左右，一個(gè)HeLa細(xì)胞則含有約250 pg蛋白質(zhì)，且不同于遺傳物質(zhì)可以擴(kuò)增，蛋白質(zhì)本身無法進(jìn)行數(shù)量的擴(kuò)增放大，因此樣品前處理損失和檢測儀器的靈敏度極大地限制了單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究的發(fā)展^[3]。近年來，隨著樣品前處理技術(shù)和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器性能的不斷進(jìn)步，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究經(jīng)歷了深度與廣度的巨大變化^[3]。2018年Rayn T. Kelly團(tuán)隊(duì)基于nanoPOTS玻璃芯片這一蛋白質(zhì)前處理技術(shù)通過減小反應(yīng)體積而減少樣本損耗，在單細(xì)胞中鑒定到了超過600個(gè)蛋白質(zhì)^[4]。2020年Zhu Ying團(tuán)隊(duì)則進(jìn)一步利用熒光激活細(xì)胞分選（FACS）實(shí)現(xiàn)對(duì)單細(xì)胞的分選，利用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（TMTs）結(jié)合ThermoFisher的Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質(zhì)譜儀在nanoPOTS蛋白前處理技術(shù)下成功從單細(xì)胞中鑒定到了超過1716個(gè)蛋白^[5]。2023年，Karl Mechtler團(tuán)隊(duì)則利用CellenONE平臺(tái)進(jìn)行單細(xì)胞分選，并使用proteoCHIP芯片進(jìn)行蛋白質(zhì)前處理，在Orbitrap Exploris 480-FAIMS質(zhì)譜儀系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞1940個(gè)蛋白的鑒定^[6]。時(shí)間進(jìn)入到2024年，浙江大學(xué)方群團(tuán)隊(duì)則利用微流控技術(shù)開發(fā)PiSPA單細(xì)胞分選技術(shù)，結(jié)合高靈敏度質(zhì)譜分析，在單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中檢測到最多3 000個(gè)蛋白質(zhì)^[7]。同年，Jesper V. Olsen團(tuán)隊(duì)利用其開發(fā)的Chip-Tip方法單細(xì)胞蛋白前處理策略集合ThermoFisher的全新一代Orbitrap Astral質(zhì)譜儀系統(tǒng)將單細(xì)胞蛋白組鑒定深度帶入一個(gè)全新的境界。利用Chip-Tip 方法，結(jié)合CellenONE高通量的從細(xì)胞懸液中分選單細(xì)胞，并在proteoCHIP-EVO96中進(jìn)行后續(xù)蛋白質(zhì)處理，結(jié)合Orbitrap Astral的窄窗口 DIA（nDIA）方法能夠穩(wěn)定的在單HeLa細(xì)胞水平鑒定到超過5 000種蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平全面的蛋白質(zhì)組學(xué)研究^[8]。

圖1 單細(xì)胞蛋白質(zhì)含量與蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量的圖示

綜上所述，隨著單細(xì)胞樣品前處理技術(shù)以及高端質(zhì)譜檢測器性能的突飛猛進(jìn)，目前單細(xì)胞蛋白質(zhì)組檢測在技術(shù)層面的難題已近于克服，當(dāng)前單細(xì)胞層面蛋白質(zhì)檢出數(shù)量已達(dá)到一個(gè)全新高度，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)在技術(shù)上的進(jìn)步已使得我們能夠以與此前完全不同的視角去研究原有的生物學(xué)問題，并與單細(xì)胞基因組、轉(zhuǎn)錄組及代謝組等研究方法互為補(bǔ)充，極大地拓展了我們探索生命奧秘的技術(shù)手段。單細(xì)胞蛋白質(zhì)組檢測在技術(shù)上的突破也使得在單細(xì)胞層面開展蛋白質(zhì)翻譯后修飾鑒定成為一種可能，然而，盡管技術(shù)進(jìn)步迅速，但由于翻譯后修飾的豐度極低、現(xiàn)有的富集策略與前處理方案存在不兼容且缺乏靈敏的檢測方案等因素的存在，在單細(xì)胞水平上對(duì)其進(jìn)行大規(guī)模分析仍然極具挑戰(zhàn)性。目前針對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行修飾組學(xué)鑒定的報(bào)道還較少，為此，本文將針對(duì)兩篇單細(xì)胞修飾鑒定佳作展開介紹，以期為各位讀者開展相關(guān)研究工作提供思路。

文章一

第一篇文章來自于丹麥哥本哈根大學(xué)Jesper V. Olsen團(tuán)隊(duì)的葉子璐博士，目前葉子璐博士已任中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院蘇州系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究所研究員^[8]。如前所述，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)樣品制備工作流程的關(guān)鍵考慮因素包括盡可能保持樣品濃縮以減少表面吸附損失，減少緩沖液蒸發(fā)和移液步驟以提高重現(xiàn)性并最大化檢測靈敏度^[8]。有基于此，作者開發(fā)了一種近乎無損的基于 LFQ單細(xì)胞蛋白質(zhì)組工作流程，作者專為單細(xì)胞樣品制備設(shè)計(jì)了名為proteoCHIP EVO 96的芯片，能夠以納升水平的最小體積運(yùn)行，可同時(shí)并行制備多達(dá) 96 個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)樣品，該芯片專門針對(duì)與 Evosep One LC 系統(tǒng)的兼容性進(jìn)行了定制，實(shí)現(xiàn)了無需額外移液步驟的簡化樣品轉(zhuǎn)移過程。利用CellenONE高通量單細(xì)胞分選設(shè)備及proteoCHIP EVO 96前處理技術(shù)，結(jié)合Orbitrap Astral的窄窗口DIA（nDIA）方法, 顯著提高了單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析的靈敏度和效率（圖 2A）。

作者通過比較分析確定了最佳的 nDIA 方法，發(fā)現(xiàn)使用 4Th DIA 窗口以及6ms 最大離子注入時(shí)間（4Th6ms）可獲得最高的蛋白質(zhì)組覆蓋度，并實(shí)現(xiàn)在單個(gè) HeLa 細(xì)胞中中位數(shù)為 5204 種蛋白質(zhì)的鑒定水平，并在其中一次 HeLa 細(xì)胞制備中鑒定出超過 6000 種蛋白質(zhì)（圖 2B）。當(dāng)進(jìn)一步擴(kuò)大細(xì)胞的數(shù)量，能夠從僅 20個(gè)細(xì)胞的樣品總鑒定出超過 7000 種蛋白質(zhì)。在肽段水平上實(shí)現(xiàn)的深度鑒定則更為顯著，單細(xì)胞樣品的肽段中位鑒定數(shù)為 41700，20個(gè)細(xì)胞樣品的肽段中位鑒定數(shù)為 98054（圖 2C），單細(xì)胞的蛋白質(zhì)序列中位覆蓋度為 12.9%，20個(gè)細(xì)胞樣品的為 25%（圖 2D）。這種高深度的肽段覆蓋也促進(jìn)了高度準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)定量，基于iBAQ值的強(qiáng)度絕對(duì)定量顯示出跨越約五個(gè)數(shù)量級(jí)的廣泛動(dòng)態(tài)范圍，相對(duì)蛋白質(zhì)豐度估計(jì)也表明，不同細(xì)胞數(shù)量樣品的 iBAQ 值幾乎呈線性關(guān)系（圖 2E）。作者也開展了不同亞細(xì)胞定位蛋白的鑒定統(tǒng)計(jì)，其中穩(wěn)定鑒定出超過 200 種質(zhì)膜蛋白，也進(jìn)一步說明了該方法的穩(wěn)健性（圖 2F）。

圖2 高通量無標(biāo)記單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的工作流程及結(jié)果
(A) 單細(xì)胞分離和蛋白質(zhì)組學(xué)處理工作流程的示意圖。(B) 使用不同的 nDIA 設(shè)置在單個(gè)、10 個(gè)、20 個(gè)和 40 個(gè) HeLa 細(xì)胞中鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量。(C) 使用不同的 nDIA 設(shè)置在單個(gè)、10 個(gè)、20 個(gè)和 40 個(gè) HeLa 細(xì)胞中鑒定的肽段數(shù)量。(D) 單細(xì)胞、10 細(xì)胞和 20 細(xì)胞樣品的蛋白質(zhì)序列覆蓋百分比。(E) 顯示不同細(xì)胞數(shù)量下定量范圍和一致性的 iBAQ 值分布。(F) 細(xì)胞區(qū)室中蛋白質(zhì)定位的概述。搜索使用了 Spectronaut（v18）

鑒于作者開發(fā)的近乎無損的基于 LFQ單細(xì)胞蛋白質(zhì)組工作流程在肽段前體水平所實(shí)現(xiàn)的高深度覆蓋鑒定，這不僅增強(qiáng)了蛋白質(zhì)鑒定和定量，還可能揭示大量與翻譯后修飾相關(guān)的信息。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者在單細(xì)胞蛋白質(zhì)組樣品中深入研究了兩種具有極高細(xì)胞重要性的翻譯后修飾-磷酸化和糖基化，蛋白質(zhì)磷酸化作為一種非常重要的翻譯后修飾，在細(xì)胞凋亡、炎癥、代謝、增殖、蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)榷喾N生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能^[9]，磷酸化信號(hào)級(jí)聯(lián)是生物體信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵分子機(jī)制，因此開展磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究一直是生命科學(xué)研究中的熱點(diǎn)之一。N-糖基化是蛋白質(zhì)一種普遍且重要的翻譯后修飾，它介導(dǎo)了包括細(xì)胞間識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫反應(yīng)以及疾病發(fā)生和發(fā)展等多種關(guān)鍵生物學(xué)過程。在許多惡性腫瘤和其他疾病中都發(fā)現(xiàn)了 N-糖基化譜的改變，因此全面表征蛋白質(zhì) N-糖基化對(duì)于增進(jìn)我們對(duì)健康和疾病的理解至關(guān)重要^[10]。為此，作者對(duì)該兩種翻譯后修飾開展不進(jìn)行任何特定富集的單細(xì)胞位點(diǎn)鑒定。

作者專注實(shí)現(xiàn)催化磷酸化反應(yīng)的激酶的發(fā)現(xiàn)，基于開發(fā)的單細(xì)胞蛋白質(zhì)方案在不進(jìn)行任何修飾富集的情況下，在單細(xì)胞內(nèi)定量了 168 種蛋白激酶，涵蓋了所有主要的激酶家族（圖 3A）。值得注意的是，來自 CMGC 組的 CDK1 和來自 STE 組的 MAPK1 等激酶表現(xiàn)出最高的豐度，而酪氨酸激酶則較少。隨后，作者在單細(xì)胞樣品中以絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨酸磷酸化為可變修飾進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索，并使用 20 個(gè)細(xì)胞樣品作為載體蛋白質(zhì)組（carrier proteome）。盡管沒有進(jìn)行任何特定的細(xì)胞刺激或樣品處理來保留磷酸化位點(diǎn)，但該搜索方法依然在單細(xì)胞中可靠地鑒定出120個(gè)絲氨酸、28個(gè)蘇氨酸和 13個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（圖 3B）。motif分析顯示出常見的磷酸化基序，這與我們的激酶組數(shù)據(jù)高度一致（圖 3C）。重要的是，對(duì)酪氨酸磷酸化在 m/z 216.042 處的選擇性亞銨離子的 DIA-MS/MS 光譜的提取離子色譜圖（XIC）篩選顯示，在整個(gè) LC 洗脫曲線中存在強(qiáng)烈信號(hào)（圖 3D）。作者還研究了蛋白質(zhì)糖基化模式，并在所有糖基化途徑中檢測到多種糖基轉(zhuǎn)移酶（圖 3E）。采用類似于磷酸酪氨酸亞銨離子篩選的策略，作者對(duì)常見聚糖進(jìn)行了氧鎓離子篩選，包括單糖 HexNAc（圖 3F）和 NeuAc（圖 3G）以及二糖 Hex-HexNAc（圖 3H）。所有聚糖都大量存在，并且在大多數(shù) MS2 光譜中都能檢測到，即使使用 nDIA 也是如此。亞銨離子和氧鎓離子的篩選表明，蛋白翻譯后修飾（如磷酸化和糖基化）在單細(xì)胞中普遍存在。

作者的研究證明了在無需特定富集方案的前提下進(jìn)行翻譯后修飾分析的可行性。這一進(jìn)展為更簡化、高效地探索翻譯后修飾位點(diǎn)乃至開展組學(xué)鑒定鋪平了道路，揭示了細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的多方面調(diào)控機(jī)制。然而，由于當(dāng)前數(shù)據(jù)庫搜索算法的限制，修飾肽段的精確鑒定仍然具有挑戰(zhàn)性。

圖3 單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)中的翻譯后修飾分析
(A) 激酶組樹狀圖，展示了單細(xì)胞中主要激酶家族的 168 種激酶的定量情況，節(jié)點(diǎn)顏色和大小表示 iBAQ 豐度。(B) 柱狀圖，描繪了單細(xì)胞和 20 細(xì)胞樣品中鑒定的絲氨酸（S）、蘇氨酸（T）和酪氨酸（Y）殘基的磷酸化位點(diǎn)數(shù)量。(C) 序列標(biāo)志分析，說明了在單細(xì)胞樣品中鑒定的最常見的磷酸化基序。(D) 磷酸酪氨酸（m/z 216.0426）的亞銨離子在液相色譜洗脫曲線中的提取離子色譜圖（XIC）。(E) 單細(xì)胞中鑒定的糖基因的可視化。(F) HexNAc（m/z 204.087）的氧鎓離子的 XIC，表明聚糖在 MS2 光譜中的存在。(G) NeuAc（m/z 274.092）的氧鎓離子的 XIC，反映了聚糖在 MS2 光譜中的豐度。(H) 二糖 Hex-HexNAc（m/z 366.139）的氧鎓離子的 XIC，反映了聚糖在 MS2 光譜中的豐度

文章二

在自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，常用的定量策略包括非標(biāo)記定量（lable free quantification，LFQ）和同位素標(biāo)記定量（isotope labeling quantification）。單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)中的早期經(jīng)典方法之一是基于串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（TMTs）的同位素標(biāo)記定量解決方案SCoPE-MS。Slavov 團(tuán)隊(duì)在 2018 年開發(fā)了基于 TMT 標(biāo)記的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析方法，利用了 TMT 載體（TMT-carrier）的概念。在該策略中，通過將單細(xì)胞通道和使用大量細(xì)胞的 TMT 載體通道（TMT-carrier channel）的信號(hào)相結(jié)合，大幅提高了肽段的 MS1 強(qiáng)度，從而觸發(fā)了顯著改進(jìn)的 MS/MS 裂解^[11]。實(shí)現(xiàn)了肽段鑒定效率的大幅提高，這有助于以更高的靈敏度和通量進(jìn)行單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析。

鑒于N-糖基化在諸多惡性腫瘤和其他疾病進(jìn)展中的重要性，在單細(xì)胞分辨率下闡明 N-糖基化模式的變化，將極大地促進(jìn)對(duì)其在腫瘤微環(huán)境和免疫治療中關(guān)鍵作用的理解。考慮到單細(xì)胞/微量細(xì)胞中樣本量極少且與富集方法不兼容，國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心（北京）的秦偉捷研究員課題組開發(fā)了一種基于 TMT 標(biāo)記的完整N-糖肽分析非富集策略（圖4）。該策略并非依賴于單個(gè)單細(xì)胞/微量細(xì)胞樣品中完N-糖肽響應(yīng)較差的 MS信號(hào)強(qiáng)度，而是將使用從大量細(xì)胞樣品中獲得的N-糖肽的TMT 載體通道與TMT研究通道中的單細(xì)胞/微量細(xì)胞混合，且不進(jìn)行富集，以獲得組合的 MS1 信號(hào)。通過這種方式，研究通道可以避免富集步驟中的樣品損失，從而支持在極少量樣品中進(jìn)行超靈敏的 N-糖肽鑒定。即使在單細(xì)胞/微量細(xì)胞中非糖肽的干擾下，N-糖肽顯著提高的 MS1 信號(hào)也能有效地觸發(fā) MS/MS 裂解，從而促進(jìn)了對(duì)單個(gè)以及50 個(gè) HeLa 細(xì)胞的首次大規(guī)模定量完整N-糖蛋白組分析。由于單細(xì)胞 / 微量細(xì)胞樣品未進(jìn)行富集步驟，該策略不受不同糖型和豐度的 N - 糖肽之間富集效率差異的影響，因此可能導(dǎo)致更準(zhǔn)確的定量結(jié)果。

圖4 基于 TMT 標(biāo)記的用于單細(xì)胞/微量細(xì)胞大規(guī)模N-糖肽鑒定的載體策略

為了驗(yàn)證這一概念和策略，作者制備了三個(gè)樣品以測試載體策略在不進(jìn)行富集的情況下從低ng水平樣品中進(jìn)行深度N-糖肽鑒定的可行性（圖 5A）。如圖 5B 所示，對(duì)于樣品 I使用 TMT10 的每個(gè)通道（不包括 126、127C 和 128C）標(biāo)記 50ng HeLa 細(xì)胞裂解消化物，并最終將七個(gè)通道合并進(jìn)行質(zhì)譜分析。對(duì)于樣品 II，使用 TMT126（載體通道）標(biāo)記從 40μg HeLa 細(xì)胞裂解消化物中富集的N-糖肽，其余通道留空。樣品III是樣品I和II的組合，以評(píng)估在不進(jìn)行富集的情況下使用載體通道促進(jìn)研究通道中痕量樣品的 N-糖肽鑒定的可行性。對(duì)于沒有載體通道的樣品 I，由于在未富集樣品中其豐度極低，僅鑒定出 112個(gè) N-糖肽。然而，在樣品 III中，通過在通道 TMT126 中添加載體N-糖肽，完整N-糖肽的數(shù)量至少增加了14倍。同樣，樣品 III 中 N-糖肽的總MS 強(qiáng)度也顯著增強(qiáng)（圖 5C），這表明應(yīng)用糖載體大大增加了在痕量樣品中鑒定和定量未富集的 N-糖肽的機(jī)會(huì)。

圖5 糖載體策略的可行性評(píng)估
(A) I、II 和 III 實(shí)驗(yàn)中的 TMT 通道分配。(B) 三個(gè)樣品中每個(gè)樣品的定量 N - 糖肽數(shù)量。(C) N - 糖肽的總強(qiáng)度。

由于糖肽豐度低、受非糖肽的抑制以及在富集過程中不可避免的樣品損失，使用直接質(zhì)譜分析或傳統(tǒng)的親水相互作用液相色譜（HILIC）富集方法，從單個(gè)和 50個(gè)HeLa 細(xì)胞中作者均未鑒定出 N-糖肽。然而，使用糖載體策略從單個(gè)和 50個(gè)HeLa 細(xì)胞中分別獲得了超過 260個(gè)和 500個(gè)N-糖肽，這表明該策略對(duì)單細(xì)胞 / 微量細(xì)胞研究具有高靈敏度（圖 6A）。如圖 6B 所示，在跨越四個(gè)數(shù)量級(jí)強(qiáng)度范圍的累積曲線中，從七個(gè)單個(gè)HeLa細(xì)胞中共獲得了608個(gè)完整的N-糖肽。對(duì)于定量分析，當(dāng)樣品量從 50 ng 減少到單個(gè)細(xì)胞時(shí)，鑒定出的 N-糖肽的強(qiáng)度分布呈現(xiàn)明顯的下降趨勢（圖 6C）。相比之下，由于基于數(shù)據(jù)依賴采集的質(zhì)譜分析的隨機(jī)性，變異系數(shù)（CV）隨著樣品量的減少而增加，并且通常預(yù)計(jì)較低的樣品量會(huì)有更高的定量波動(dòng)。然而，少量細(xì)胞（10 個(gè)和50個(gè)細(xì)胞）的CV僅略高于50 ng樣品中的CV，這表明糖載體策略具有高重現(xiàn)性。對(duì)于單細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)較高的CV,這可能部分歸因于單個(gè)細(xì)胞之間的異質(zhì)性（圖 6D）。此外，作者還將糖載體策略應(yīng)用于50個(gè)細(xì)胞水平的三種細(xì)胞系（HeLa、AC16 和 A549）的差異 N-糖蛋白組分析。如圖 6E 所示，對(duì)定量的完整N-糖肽進(jìn)行主成分分析（PCA），結(jié)果表明細(xì)胞按細(xì)胞類型分組，三種細(xì)胞系之間存在明顯差異，這進(jìn)一步證明了糖載體策略的定量重現(xiàn)性。重復(fù)之間的技術(shù)差異低于細(xì)胞類型之間的 N - 糖蛋白組模式差異，這表明該策略能夠識(shí)別細(xì)胞異質(zhì)性。進(jìn)一步將樣品量減少到單細(xì)胞水平揭示了不同 HeLa 細(xì)胞之間的細(xì)胞異質(zhì)性。在無監(jiān)督層次聚類分析中發(fā)現(xiàn)了單個(gè) HeLa 細(xì)胞中 N - 糖肽的差異表達(dá)（圖 6F）。作為概念驗(yàn)證，該策略成功區(qū)分了三種不同的細(xì)胞系，并利用完整的 N-糖肽譜發(fā)現(xiàn)了小鼠大腦中小膠質(zhì)細(xì)胞（MG）的區(qū)域異質(zhì)性，表明其在生物和生物醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用潛力。

圖6 單細(xì)胞和微量細(xì)胞中完整 N - 糖肽的分析
(A) 從單個(gè)、10 個(gè)和 50 個(gè) HeLa 細(xì)胞以及 50ng HeLa 酶解物中獲得的完整 N - 糖肽數(shù)量。(B) 從大量 HeLa 酶解物和單個(gè) HeLa 細(xì)胞中累積鑒定出的 N - 糖肽。(C) 強(qiáng)度比較。(D) 從單個(gè)、10 個(gè)和 50 個(gè) HeLa 細(xì)胞以及 50ng HeLa 酶解物中獲得的 N - 糖肽的變異系數(shù)（CV）分布（n = 7）。(E) 來自三種細(xì)胞系的 N - 糖肽的主成分分析（n = 14）。(F) 單個(gè) HeLa 細(xì)胞的 N - 糖肽的無監(jiān)督層次聚類

綜上所述，基于等壓標(biāo)記TMT的載體策略，作者使用高場非對(duì)稱波形離子遷移譜儀FAIMS聯(lián)用Orbitrap Exploris 480 質(zhì)譜儀進(jìn)行非富集單細(xì)胞N-糖肽分析。使用從大量細(xì)胞樣本中獲得的 N-糖肽作為載體通道，顯著提高了 N-糖肽的 “總” 信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè) HeLa 細(xì)胞平均260個(gè) N-糖肽的首次定量分析。

總結(jié)

由于翻譯后修飾的豐度極低、現(xiàn)有的富集策略與前處理方案存在不兼容且缺乏靈敏的檢測方案等因素的存在，在單細(xì)胞水平上對(duì)翻譯后修飾進(jìn)行大規(guī)模分析仍然極具挑戰(zhàn)性。隨著單細(xì)胞樣品前處理技術(shù)以及高端質(zhì)譜檢測器性能的突飛猛進(jìn)，在無需特定富集方案的前提下進(jìn)行翻譯后修飾分析已成為可能。基于載體蛋白組的SCoPE-MS策略能夠提高整體樣品的蛋白質(zhì)含量，從而降低對(duì)LC-MS系統(tǒng)的靈敏度要求。此外，當(dāng)前已有最高通量為32 plex的TMT標(biāo)簽，在不加入載體蛋白質(zhì)的情況下能夠同時(shí)對(duì)32個(gè)樣本進(jìn)行相對(duì)定量分析，能夠顯著提升單細(xì)胞蛋白質(zhì)（修飾組）的分析通量^[3]。相信未來結(jié)合數(shù)據(jù)庫單細(xì)胞修飾搜索算法的優(yōu)化，基于無損樣品前處理在超高靈敏度質(zhì)譜系統(tǒng)Orbitrap Astral/Ascend Tribrid的加持下，單細(xì)胞修飾的鑒定將會(huì)迎來嶄新的局面。

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