生物制品中HCP的LCMS定性和定量分析建議
宿主細胞蛋白
宿主細胞蛋白（HCP， host cell protein）是宿主細胞表達的除目標蛋白以外的其它蛋白的總稱。研究表明，一些HCP對抗體的免疫原性、穩(wěn)定性和抗體輔料的穩(wěn)定性有著較大的影響1。因此，生物制品從發(fā)酵到成品需要經歷一系列純化步驟，用于去除HCP等非目標組分。經過了純化步驟后，殘留的HCP通常含量極低（1-100 ppm），但由于HCP的高風險性，即使其殘留量很低，仍然需要監(jiān)控。低含量的組分，尤其是存在于高濃度主體中的低含量組分的檢測是對分析技術的極大挑戰(zhàn)，這些挑戰(zhàn)表現(xiàn)在靈敏度、動態(tài)范圍和選擇性等方面。
靈敏度和選擇性俱佳的ELISA（酶聯(lián)免疫吸附法）成為HCP檢測的金標準。但ELISA也存在一定的局限，例如稀釋不成線性、缺少HCP種類信息等。隨著LCMS在蛋白組學領域的成功使用，各大企業(yè)將LCMS引入到HCP的檢測中2-7，USP也在2023年將LCMS檢測方法引入通則，與ELISA法互為補充。本文系統(tǒng)介紹LCMS檢測HCP的樣品前處理、數(shù)據采集、數(shù)據處理和泛HCP概念的應用。
靈敏度和選擇性俱佳的ELISA（酶聯(lián)免疫吸附法）成為HCP檢測的金標準。但ELISA也存在一定的局限，例如稀釋不成線性、缺少HCP種類信息等。隨著LCMS在蛋白組學領域的成功使用，各大企業(yè)將LCMS引入到HCP的檢測中2-7，USP也在2023年將LCMS檢測方法引入通則，與ELISA法互為補充。本文系統(tǒng)介紹LCMS檢測HCP的樣品前處理、數(shù)據采集、數(shù)據處理和泛HCP概念的應用。
01 樣品前處理
如表1所示，HCP的前處理通常分為三類：標準酶解、去除主蛋白的酶解策略、富集HCP的前處理策略。這些前處理方法各有優(yōu)缺點。通常情況下，抗體的酶解選擇native酶解法，也就是在pH 7-8的緩沖溶液中加入蛋白酶直接酶切（不做變性、還原和烷基化處理）。這個方法由Huang在2017年使用到NIST Mab的HCP檢測中，是一種簡單有效的方法3。主要的原理是，在native條件下抗體的酶解是被限制的，而與抗體具有不同性質的HCP可以酶解得到相應的肽段，因此最終得到的酶解溶液中主蛋白的肽段濃度低于常規(guī)酶解。Native酶解和標準酶解所得肽譜對比如圖1所示。除了native酶解，還有國內廠家使用磁珠法富集HCP。此外，對于非抗體類的重組蛋白，例如AAV，由于主蛋白的含量很低，native酶解并沒有顯著優(yōu)勢，可以嘗試標準酶解。為了實現(xiàn)產品中HCP的全面檢測，有必要進行多種前處理方法合并研究。
表1 HCP的LCMS檢測常見前處理方法
圖1 native酶解與標準酶解的肽譜對比圖
02 分離方法
圖1 native酶解與標準酶解的肽譜對比圖
02 分離方法
HCP樣品的分離可以有多種方法，我們將這些方法的優(yōu)缺點對比如表2所示。初期產品的研究，建議使用nanoLC-MS開展相關研。相對與UHPLC-MS，nanoLC-MS即使使用5 µm粒徑的色譜填料，靈敏度也可以高50-200倍，如果使用亞2µm的填料，可以獲得更高的靈敏度8。NanoLC-MS的高靈敏可以實現(xiàn)0.1 ppm HCP的檢測，這樣的靈敏度是常規(guī)液相（包括2DLC）無法實現(xiàn)的6。
表2 常見的HCP分離方法對比
03 采集方法和分析軟件
常見的采集方法如表3所示。在產品的初期，建議使用DDA或者DIA的采集方法探索樣品中HCP的種類和大致含量，待產品成熟后可以轉為MRM/PRM的方法對特定的HCP進行定量檢測。DDA和DIA的好處是可以同時監(jiān)測多種HCP的含量、包括目標和非目標HCP的檢測。MRM/PRM更傾向于目標HCP的檢測�？梢詸z索DDA采集數(shù)據的軟件通常比DIA更多，如mascot、Proteome Discoverer （PD）、BioPharma Finder (BPF) 、pFind等。但隨著DIA的采集方法越來越成熟，可以支持DIA數(shù)據檢索的軟件也越來越多，例如PD、Spectronuat和DIA-NN等。需要注意的是，因為不同的軟件卡值標準不同，所以檢索的結果會存在差異，為了實現(xiàn)更為全面的HCP檢索，可以將不同軟件檢索的結果合并分析，最后選擇重點關注的HCP種類做深入研究。
表3 HCP常見的采集方法對比
04 HCP的定量
04 HCP的定量
HCP的定量可以選擇三種不同的方式，如表4所示。標準蛋白添加的方式可以同時定量多種HCP，但定量的結果與標準肽段添加存在差異。標準蛋白添加的定量理論來源于Hi3原則，如公式1。得到HCP的物質的量后，可以參考公式2計算HCP的含量。
表4 HCP的定量方法
05 報告內容
一份定性的HCP報告，需要包含HCP的種類、pI點和分子量。定量分析的HCP報告除了包含定性的內容以外，還需要報告HCP的含量，例如ppm或者物質的量。需要注意的是，因為LCMS和ELISA的檢測原理不同，LCMS定量的單個HCP的含量之和與ELISA定量的HCP總量不具有換算關系。將兩種方法用于HCP的定量并非是為了統(tǒng)一，而是互為補充，當其中任何一種方法檢測得到的HCP含量高都需要繼續(xù)研究。
當報告產品中沒有HCP存在，需要提供檢測方法的靈敏度�？梢栽跇悠分刑砑拥鞍鬃鳛榉椒ǖ撵`敏度檢測。用于靈敏度和HCP定量的標準蛋白，需要純度、序列（包括修飾）和質量已知。如果報告產品中存在HCP，需要提供檢測方法的carryover數(shù)據，也就是blank樣品中不應該這些蛋白的檢出。此外，一旦確定樣品中含有HCP，需要用人為添加的方式做驗證。
當報告產品中沒有HCP存在，需要提供檢測方法的靈敏度�？梢栽跇悠分刑砑拥鞍鬃鳛榉椒ǖ撵`敏度檢測。用于靈敏度和HCP定量的標準蛋白，需要純度、序列（包括修飾）和質量已知。如果報告產品中存在HCP，需要提供檢測方法的carryover數(shù)據，也就是blank樣品中不應該這些蛋白的檢出。此外，一旦確定樣品中含有HCP，需要用人為添加的方式做驗證。
06 HCP概念的外延
LCMS檢測重組蛋白中HCP的種類和含量的思路來源于蛋白組學。蛋白組學的研究思路不僅可以用于HCP的分析，還可以用于其它非重組生物制品，例如天然提取生物制品的蛋白組成和含量分析9、病毒類疫苗10和細菌類疫苗11的蛋白組成分析等，為這些生物制品的質量評價提供思路。
小結與展望
無論什么樣本，只要想獲取可靠的HCP報告，必須具備兩個條件：
1）采集可靠的原始數(shù)據；
2）采用強大的軟件提供可靠的HCP報告內容。
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參考文獻：
1. Vanderlaan, M.; Zhu-Shimoni, J.; Lin, S.; Gunawan, F.; Waerner, T.; Van Cott, K. E., Experience with host cell protein impurities in biopharmaceuticals. Biotechnol Prog 2018, 34 (4), 828-837.
2. Hessmann, S.; Chery, C.; Sikora, A.-S.; Gervais, A.; Carapito, C., Host cell protein quantification workflow using optimized standards combined with data-independent acquisition mass spectrometry. J Pharm Anal 2023, 13 (5), 494-502.
3. Huang, L.; Wang, N.; Mitchell, C. E.; Brownlee, T.; Maple, S. R.; De Felippis, M. R., A Novel Sample Preparation for Shotgun Proteomics Characterization of HCPs in Antibodies. Analytical Chemistry 2017, 89 (10), 5436-5444.
4. Johnson, R. O. B.; Greer, T.; Cejkov, M.; Zheng, X.; Li, N., Combination of FAIMS, Protein A Depletion, and Native Digest Conditions Enables Deep Proteomic Profiling of Host Cell Proteins in Monoclonal Antibodies. Analytical Chemistry 2020, 92 (15), 10478-10484.
5. Wang, X.; Hunter, A. K.; Mozier, N. M., Host cell proteins in biologics development: Identification, quantitation and risk assessment. Biotechnology and Bioengineering 2009, 103 (3), 446-458.
6. Yang, F.; Li, D.; Kufer, R., Versatile LC-MS-Based Workflow with Robust 0.1 ppm Sensitivity for Identifying Residual HCPs in Biotherapeutic Products. 2022, 94 (2), 723-731.
7. Zhang, X.; Chen, Z.; Li, B.; Sutton, J.; Du, M., LC-MS-based host cell protein (HCP) identification and monitoring during biopharmaceutical downstream process development. AN 2021, 74162.
8. Bian, Y.; Zheng, R.; Bayer, F. P.; Wong, C.; Chang, Y.-C.; Meng, C.; Zolg, D. P.; Reinecke, M.; Zecha, J.; Wiechmann, S., Robust, reproducible and quantitative analysis of thousands of proteomes by micro-flow LC–MS/MS. Nature communications 2020, 11 (1), 157-168.
9. Long, Z.; Zhao, Z.; Fan, X.; Luo, X., Comparison of analytical-flow, micro-flow and nano-flow LC-MS/MS for sub-proteome analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2025, 252, 116484.
10. Long, Z.; Wei, C.; Dong, X.; Li, X.; Yang, H.; Deng, H.; Ma, X.; Yin, S.; Qi, Y.; Bo, T., Simultaneous quantification of spike and nucleocapsid protein in inactivated COVID-19 vaccine bulk by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B 2021, 1181, 122884.
11. Long, Z.; Wei, C.; Ross, R.; Luo, X.; Ma, X.; Qi, Y.; Chai, R.; Cao, J.; Huang, M.; Bo, T., Effects of detoxification process on toxicity and foreign protein of tetanus toxoid and diphtheria toxoid. Journal of Chromatography B 2022, 1207, 123377.
1）采集可靠的原始數(shù)據；
2）采用強大的軟件提供可靠的HCP報告內容。
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