導(dǎo)語
胰腺癌是導(dǎo)致癌癥死亡的主要疾病之一，且預(yù)計到2040年將成為第二大死因。盡管治療手段有所進步，但胰腺癌的五年生存率仍然很低，因為大多數(shù)患者在診斷時已處于晚期。因此，需要深入了解胰腺癌的生物學(xué)特性以改善治療效果。本研究通過單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）和空間轉(zhuǎn)錄組測序（ST -seq)分析胰腺癌組織，以揭示腫瘤微環(huán)境中的異質(zhì)性。對17名胰腺腫瘤患者樣本進行了深度測序。分析揭示了胰腺癌腫瘤微環(huán)境中的異質(zhì)性，并發(fā)現(xiàn)了一個新的癌細(xì)胞亞群Ep_VGLL1，它具有介于經(jīng)典型和基底樣亞型之間的中間特征，可能代表了胰腺癌進展中的一個過渡狀態(tài)。這一發(fā)現(xiàn)為胰腺癌的治療提供了新的視角和潛在的治療靶點。

主要技術(shù)
scRNA-seq、ST -seq

研究結(jié)果
1. 胰腺癌細(xì)胞和CAF的全面單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖
為了解釋癌細(xì)胞和CAF的異質(zhì)性，研究人員對17名胰腺腫瘤患者（包括16名胰腺癌患者和1名帶有高級別異型增生的胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀粘液性腫瘤，IPMN）的手術(shù)樣本進行單細(xì)胞RNA測序，富集了CD45陰性細(xì)胞（圖1A）。鑒定出了五種主要的細(xì)胞類型：上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血旺細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和星狀細(xì)胞（圖1B）。隨后，研究人員使用拷貝數(shù)變異推斷工具來識別癌癥細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)預(yù)測的惡性細(xì)胞位于上皮細(xì)胞群體中（圖1C）。進一步對上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞進行了亞群聚類，以便進一步進行特征描述。胰腺癌上皮細(xì)胞通過每個群特異性的marker基因注釋成9個簇（圖 1D）。研究人員特別關(guān)注KRAS基因G12位點的突變狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)Ep_FXYD2亞群中的細(xì)胞大多含有野生型KRAS序列，暗示這些細(xì)胞可能代表非癌性上皮細(xì)胞，是癌前導(dǎo)管樣細(xì)胞。研究還識別出Ep_CDK1亞群為增殖的癌上皮細(xì)胞，具有明顯的細(xì)胞周期標(biāo)志物（圖1D）。最終，分析確定了不包括癌前Ep_FXYD2亞群和循環(huán)Ep_CDK1亞群共六種癌細(xì)胞亞群，這些亞群在增殖上表現(xiàn)出差異，其中Ep_TRIM54、Ep_KRT6A和Ep_VGLL1在循環(huán)細(xì)胞群體中富集，表明它們相對更具增殖性（圖1E）。同樣對成纖維細(xì)胞進行聚類分析，得到了八個成纖維細(xì)胞亞群（圖1F）。排除Fb_Base和Fb_CDK1亞群，確定了六個具有獨特基因表達(dá)特征的胰腺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）亞群，包括三個已被充分描述的CAF群體：Fb_SFRP1（炎癥性CAF，iCAF）、Fb_LRRC15（肌成纖維細(xì)胞性CAF，myCAF）和Fb_MSLN（抗原呈遞CAF，apCAF）。
 

圖 1

2. 基于群體的聚類揭示了胰腺癌的病理和分子亞型。
在確定了胰腺癌組織中癌細(xì)胞和CAF詳細(xì)亞群后，接下來想知道是否可以根據(jù)這些單細(xì)胞群的組成對患者進行分層。研究發(fā)現(xiàn)，基于癌細(xì)胞和CAF亞群組成的不同，可以將患者分為三個明顯的群，即hClust0-2。其中，hClust0群中富含IPMN相關(guān)的樣本，而hClust1和hClust2群中晚期疾病狀態(tài)的患者更為集中。每個患者群都與特定的癌細(xì)胞亞群顯著相關(guān)：hClust0與Ep_MSMB亞群相關(guān)，hClust1與Ep_TRIM54亞群相關(guān)，而hClust2與Ep_KRT6A和Ep_VGLL1亞群相關(guān)。此外，還發(fā)現(xiàn)hClust0群的CAF亞群多樣性較低，主要由Fb_COL9A1亞群主導(dǎo)。這些發(fā)現(xiàn)通過層次聚類分析（圖2B、C）和臨床數(shù)據(jù)對比得到了驗證（圖2D、E）。每個患者群都可以通過特定癌細(xì)胞亞群的顯著富集來標(biāo)記（圖 2F）。并且通過比較與胰腺癌亞型相關(guān)的基因表達(dá)特征進一步表征了患者群體（圖2G）。同時，也觀察到hClust0群體中CAF亞群的特定分布，多樣性低于其他的患者群（圖2H、I）。
 

圖 2

3. Ep_VGLL1：一種與不良預(yù)后相關(guān)的新型胰腺癌細(xì)胞群
接下來，使用公共數(shù)據(jù)評估癌癥和CAF簇的預(yù)后價值。在所有上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞亞群中，只有Ep_KRT6A和Ep_VGLL1的標(biāo)志物具有預(yù)后意義，它們表示不良預(yù)后（圖3A、B）。高Ep_KRT6A組的不良預(yù)后是可預(yù)測的，因為它具有基底樣特征，與Ep_VGLL1組不同，Ep_VGLL1組沒有顯示任何先前定義的特征（圖2G）。通路富集分析清楚地表明，與Ep_VGLL1相比，Ep_KRT6A表達(dá)更高水平的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）基因集（圖3C）。此外，Ep_KRT6A評分與整個癌細(xì)胞的EMT評分呈明顯正相關(guān)，與Ep_VGLL1評分無相關(guān)性（圖3D）。最重要的是，PDAC組織的RNA原位雜交圖像清楚地分離了表達(dá)VGLL1的細(xì)胞和表達(dá)KRT6B的細(xì)胞（圖3E）。
 

圖 3

4. 解讀調(diào)控胰腺癌細(xì)胞簇的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)
為明確癌細(xì)胞簇的生物學(xué)特性，通過SCENIC分析各亞群中轉(zhuǎn)錄因子（TF）活性（圖4A）。值得注意的是，推斷出的TF活性被分為不同的群，這些群與上皮亞群有很好的相關(guān)性。接著，基于TF活性數(shù)據(jù)重建相關(guān)性TF網(wǎng)絡(luò)（圖4B），依上皮細(xì)胞群特性命名各組TF：Ep_MSMB對應(yīng)“IPMN-associated”；Ep_TRIM54含高活性“classical”TF，Ep_KRT6A等含“basal-like”TF，二者對比鮮明；“EMT-related”TF群含關(guān)鍵調(diào)控因子，對Ep_KRT6A有高度特異性；還識別出Ep_VGLL1特異性TF，處于關(guān)鍵連接位置。最后，TF活性的擴散圖與PCA投影顯示，Ep_VGLL1對應(yīng)的TF群位于“classical”和“basal-like”群中點，由此推測Ep_VGLL1代表過渡癌細(xì)胞群體，其特異性TF標(biāo)注為“transitional”（圖4C）。
 

圖 4

5. Ep_VGLL1的分子特征表明其具有過渡特性
通過TF分析發(fā)現(xiàn)，Ep_VGLL1呈現(xiàn)出獨特的SOX4與KLF5活性水平（圖 5A）。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，Ep_VGLL1中SMAD4 平均表達(dá)量處于低位，與基底樣群相當(dāng)，這暗示它具備基底樣特性；同時，該群中經(jīng)典胰腺癌替代標(biāo)志物GATA6表達(dá)量低，體現(xiàn)出其非經(jīng)典性質(zhì)，且已知GATA6與Wnt信號通路依賴相關(guān)，低表達(dá)也意味著 Ep_VGLL1 具有Wnt獨立性（圖 5B）。細(xì)胞間通訊分析結(jié)果顯示，Ep_VGLL1 能夠作為信號發(fā)送者參與 Wnt 信號通路（圖 5C），利用過往報道的 Wnt 依賴基因特征進行分析，發(fā)現(xiàn)Ep_VGLL1 和其他基底樣簇一樣，有著明顯的 Wnt 獨立特征（圖 5D）。由于KLF5 是維持多種細(xì)胞類型上皮細(xì)胞特性的關(guān)鍵要素，對Ep_VGLL1細(xì)胞身份的探究發(fā)現(xiàn)，它高表達(dá)緊密連接蛋白基因TJP1與OCLN，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物VIM、S100A4表達(dá)量低，這有別于其他基底樣簇，表明其仍保留上皮細(xì)胞特性（圖 5E）。近期有報道稱，在FOLFIRINOX治療下，胰腺癌腫瘤球體細(xì)胞會通過癌內(nèi)在機制發(fā)生從經(jīng)典型到基底樣的轉(zhuǎn)變。利用自身的亞群標(biāo)志物追蹤這一轉(zhuǎn)變過程，結(jié)果顯示Ep_TRIM54特征隨時間逐漸減少，Ep_KRT6A 特征不斷增加，而Ep_VGLL1特征在第4天達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，恰好位于Ep_KRT6A 激增之前（圖 5F）。綜合來看，這些結(jié)果揭示出Ep_VGLL1 群處于中間過渡狀態(tài)，很可能代表著基底樣與經(jīng)典型癌細(xì)胞之間的過渡群體。
 

圖 5

6. 空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)揭示人類胰腺癌中癌癥亞群和相關(guān)微環(huán)境的動態(tài)
研究人員利用癌細(xì)胞和CAF亞群的詳細(xì)參考圖譜來探究人類胰腺癌的空間復(fù)雜性。從scRNA-seq隊列中生成了7對空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并使用貝葉斯推斷模型對這些數(shù)據(jù)進行分析，以識別不同細(xì)胞類型和亞群的空間分布模式（圖6A）。隨后，比較了scRNA數(shù)據(jù)和配對空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中癌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞亞群 (圖6B-C) 的組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的癌細(xì)胞亞群組成與單細(xì)胞數(shù)據(jù)中的癌細(xì)胞組成高度一致 (圖 6D)，而成纖維細(xì)胞組成則不同 (圖6E-F)。
 

圖 6

7. 胰腺癌中癌細(xì)胞亞群與腫瘤微環(huán)境的空間關(guān)聯(lián)性研究
在這項研究中，研究人員還關(guān)注胰腺癌中基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的分布以及它們與癌細(xì)胞亞群的空間相關(guān)性。通過鄰接網(wǎng)絡(luò)圖，區(qū)分了靠近和不靠近癌細(xì)胞的細(xì)胞類型（圖7A-C）。還發(fā)現(xiàn)，肌成纖維細(xì)胞CAF群的代表Fb_LRRC15在空間分布上與胰腺癌細(xì)胞高度相關(guān)（圖7D），而炎癥成纖維細(xì)胞iCAF的代表Fb_SFRP1則位于遠(yuǎn)離癌癥區(qū)域的位置（圖7E）。值得注意的是，主要的癌細(xì)胞亞群Ep_TRIM54、Ep_VGLL1和Ep_KRT6A均未顯示出對Fb_LRRC15的偏好（圖7D）。這一點與單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)一致，即這些癌細(xì)胞亞群單獨與Fb_LRRC15無相關(guān)性，但它們的總和與Fb_LRRC15的比例高度相關(guān)（圖7F）。
 

圖 7

結(jié)論
本研究通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄組，對胰腺癌腫瘤微環(huán)境中的上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞進行了全面分析。鑒定了五種不同的功能性胰腺癌細(xì)胞亞群和六種不同的癌相關(guān)成纖維細(xì)胞亞群。在這些亞群中，識別了一個新型的癌細(xì)胞亞群Ep_VGLL1，它顯示出介于基底樣和經(jīng)典亞型之間的中間特征，這一點得到了空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的支持。這種綜合性分析不僅提供了胰腺癌和成纖維細(xì)胞群體的全面景觀，還為胰腺癌細(xì)胞的動態(tài)狀態(tài)提供了新的見解，并揭示了潛在的治療靶點。

參考文獻：
Kim S, Leem G, Choi J, et al. Integrative analysis of spatial and single-cell transcriptome data from human pancreatic cancer reveals an intermediate cancer cell population associated with poor prognosis. Genome Med. 2024 Jan 31;16(1):20. doi: 10.1186/s13073-024-01287-7. PMID: 38297291; PMCID: PMC10832111.