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JEV文獻(xiàn)解讀:一種新型外泌體支架蛋白的發(fā)現(xiàn)及其優(yōu)勢與應(yīng)用

瀏覽次數(shù):261 發(fā)布日期:2024-12-13  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)

外泌體是細(xì)胞分泌的納米級囊泡,它們在細(xì)胞間通訊中扮演著關(guān)鍵角色,并參與多種生理和病理過程。外泌體不僅攜帶蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及核酸等生物分子,還具有穿越多種生物屏障等能力,為靶向藥物遞送和基因治療提供了一個全新的平臺。外泌體工程化技術(shù)經(jīng)由基因改造或化學(xué)修飾等手段提高外泌體的生物活性、穩(wěn)定性以及靶向性,在外泌體藥物遞送及治療應(yīng)用中具有重要應(yīng)用前景。其中通過基因工程方式作為內(nèi)源性工程化外泌體改造的重要方式,在工程化外泌體的開發(fā)中備受關(guān)注。

近日,北京恩澤康泰生物科技有限公司在外泌體工程化改造領(lǐng)域取得重大進(jìn)展,其研究成果發(fā)表于Journal of Extracellular Vesicles。這一發(fā)現(xiàn)拓寬了外泌體支架蛋白的選擇范圍,為外泌體在藥物遞送和基因治療中的應(yīng)用提供了新的可能性。

 

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研究背景
由于外泌體能夠調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物表型,大家越來越關(guān)注其作為新型治療載體的潛力。外泌體具備免疫原性有限、毒性低和跨越血腦屏障能力等優(yōu)勢,可保護(hù)封裝的貨物分子以及體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的穩(wěn)定性,克服了合成藥物遞送系統(tǒng)的局限性。但外泌體的臨床應(yīng)用也面臨諸多挑戰(zhàn),如給定生物分子含量低、循環(huán)時間短、肝臟主導(dǎo)的生物分布等。此外,量產(chǎn)工藝不成熟和缺乏完善的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)也限制了其發(fā)展。為了克服上述的問題,科研人員通過基因工程或化學(xué)修飾對外泌體進(jìn)行工程化改造,以改善其生物活性、載藥能力和靶向性等。改造方法之一是將目標(biāo)蛋白(protein of interest,POI)通過與支架蛋白融合的方式導(dǎo)入外泌體,實現(xiàn)生成前的蛋白質(zhì)改造或內(nèi)源蛋白質(zhì)改造。這種方法可以實現(xiàn)穩(wěn)定大批量制備,并根據(jù)需要將POI展示在外泌體的表面或內(nèi)部。目前,常見的外泌體支架蛋白分為三類,分別是四跨膜蛋白(CD63,CD9,CD81等)、膜周蛋白(MFGE8),以及I型跨膜蛋白(Lamp2b,PTGFRN等)三類。但這些支架蛋白仍存在不足,如四跨膜蛋白的N端和C端均位于膜內(nèi),當(dāng)需要在外泌體的表面展示POI時,只能對外表面的loop結(jié)構(gòu)進(jìn)行融合改造,加大了分子設(shè)計和驗證的難度;膜周蛋白MFGE8與膜表面蛋白的結(jié)合力弱,一旦融合分子量較大的POI后,在外泌體上的含量就會迅速降低;Lamp2b適合N端融合,C端融合則會影響其分揀能力。為了讓外泌體工程化改造技術(shù)能夠更好地服務(wù)于外泌體創(chuàng)新療法的開發(fā),篩選新型支架蛋白的努力從未停止。而此前篩選外泌體支架蛋白的標(biāo)準(zhǔn)主要包括以下四點:

  1. 在外泌體上的高水平表達(dá);
  2. 較小的分子量;
  3. 具有適合的改造位點;
  4. 本身不應(yīng)具有明顯的生物學(xué)功能。


然而,能夠同時滿足上述四個條件的候選蛋白數(shù)量有限。因此,本文的研究者在此研究策略之上,將支架蛋白的篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了大幅度的精簡,從之前的四個減少到以下兩個:

  1. 必須是具有外泌體主動分揀能力的I型跨膜蛋白;
  2. 在該蛋白的N端以及C端進(jìn)行截短或融合等改造不會顯著影響該蛋白向外泌體分揀的能力。

一、PLXNA1的篩選與鑒定
研究者首先通過高分辨蛋白組學(xué)技術(shù)對EV中不同蛋白質(zhì)的分揀能力進(jìn)行了初步評估。結(jié)果顯示,叢蛋白A1(PLXNA1)與經(jīng)典的外泌體富集蛋白(MFGE8、CD81、PTGFRN以及SDCBP等)類似,其相對豐度在細(xì)胞裂解液(CL)、初純外泌體(UC)和高純外泌體(DGC)之中依次呈現(xiàn)出由低到高的趨勢,而與外泌體樣本中常見的污染蛋白(CANX)呈現(xiàn)出相反的趨勢(圖1c)。并且其在外泌體中的富集程度相較于細(xì)胞裂解液有了顯著提升,其增加的倍數(shù)在所有比較的外泌體富集蛋白中排名第二,僅次于MFGE8(圖1d)。且該結(jié)果得到Western Blot(WB)驗證(圖1e)。這些結(jié)果表明PLXNA1滿足了研究者設(shè)定的第一個篩選標(biāo)準(zhǔn),即具有外泌體主動分揀能力的I型跨膜蛋白。
 

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圖1. PLXNA1的篩選與鑒定

二、NanoFCM和WB作為評估支架蛋白EV分揀能力的有效方法
為了評估PLXNA1是否滿足篩選標(biāo)準(zhǔn)的第二個要求,研究者開發(fā)了一種基于WB和納米流式的方法來評估候選支架蛋白的EV分揀能力。WB是從整體水平上對樣本蛋白進(jìn)行檢測,而NanoFCM則是在單顆粒水平上檢測蛋白陽性率以及平均熒光強(qiáng)度(MFI)。這兩種方法的結(jié)合有助于全面評估PLXNA1的EV分揀能力。作者將GFP與支架蛋白CD63和MFGE8分別融合表達(dá),通過ELISA和WB評估GFP蛋白分別在EV和CL中的含量以及比值。結(jié)果顯示兩種方法的結(jié)果是一致的,且GFP-CD63的富集程度略高于GFP-MFGE8(圖2b,c,d)。而與之不同的是,NanoFCM的MFI結(jié)果表明,GFP-MFGE8優(yōu)于GFP-CD63(圖2e,f),這是因為GFP MFI反映了融合蛋白的EVs中的表達(dá),而與細(xì)胞中可能殘留的融合蛋白的數(shù)量無關(guān)。

 

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圖2. PLXNA1的EV分揀能力評估

三、PLXNA1截短和融合不影響外泌體的分揀能力
按照前述的篩選標(biāo)準(zhǔn),PLXNA1作為外泌體支架蛋白仍存在天然劣勢。首先,其N端和C端各有一個具有生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)域;其次,該蛋白的分子量較大,約為211kDa。所以全長的PLXNA1并不適合作為外泌體支架蛋白。于是研究者對PLXNA1進(jìn)行了五種不同形式的截短,并且在N端和C端與不同的貨物分子(即IL 12和GFP)進(jìn)行融合改造,結(jié)果顯示該蛋白的多個截短體均保持了較高的外泌體分揀能力(圖3a,b,c)。這說明PLXNA1也同樣滿足篩選標(biāo)準(zhǔn)的第二條要求,即支架蛋白的N端以及C端進(jìn)行截短或融合等改造不會顯著影響該蛋白向外泌體分揀的能力。

 

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圖3. 截短的PLXNA1保持了較高的EV分揀能力

四、PLXNA1截短體作為外泌體支架蛋白的優(yōu)勢
為進(jìn)一步闡明PLXNA1截短體在EV分揀中的優(yōu)勢,研究者將PLXNA1截短體與另外兩種廣泛認(rèn)可的I型跨膜支架蛋白(Lamp2b和PTGFRN)進(jìn)行了頭對頭的比較,在HEK293和MCF-7細(xì)胞系中PLXNA1截短體均展現(xiàn)出了明顯的載量優(yōu)勢(圖4)。

 

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圖4. PLXNA1截短體相較于已知支架具有優(yōu)勢

研究者進(jìn)一步設(shè)計實驗來驗證POI在EV表面和腔內(nèi)的活性。研究者首先將PLXNA1(863-1316)和核糖體蛋白L7AE進(jìn)行融合,并與目標(biāo)mRNA(帶有C/D盒序列的NanoLuc mRNA)共轉(zhuǎn)染到293F細(xì)胞中,然后將產(chǎn)生的EV與HepG2細(xì)胞共孵育,以測試融合表達(dá)是否會影響L7AE的RNA結(jié)合能力。孵育實驗發(fā)現(xiàn),NanoLuc-L7AE-EV處理的細(xì)胞中,NanoLuc mRNA水平顯著上調(diào),且NanoLuc催化活性比用NanoLuc-EV處理的細(xì)胞高出四倍,表明L7AE工程化EVs在遞送目標(biāo)mRNA方面具有優(yōu)勢(圖5b)。此外,若siRNA技術(shù)干擾表達(dá)下,NanoLuc-L7AE-EV處理的細(xì)胞活性降低了30%,進(jìn)一步證實了受體細(xì)胞中的NanoLuc催化活性來源于mRNA的成功遞送(圖5c)。

進(jìn)一步的實驗中,研究者將NanoLuc蛋白直接融合并表達(dá)在PLXNA1(863-1316)的C端,體外實驗也表現(xiàn)出劑量依賴性的底物催化活性(圖5d)。同時,將小鼠IL12(mIL12)與PLXNA1的N端融合,發(fā)現(xiàn)重組mIL12(rmIL12)和mIL12修飾的EVs(EVmIL12)體外實驗中引發(fā)的IFN-γ激活水平相同(圖5e)。這些結(jié)果表明,無論是與支架蛋白的C端還是N端融合,對蛋白質(zhì)貨物的功能影響有限。

最后,在攜帶MC38腫瘤的小鼠模型中,比較了rmIL12和EVmIL12對腫瘤生長抑制活性的影響。結(jié)果顯示,EVmIL12在相同劑量下比rmIL12表現(xiàn)出更有效的腫瘤生長抑制活性,并且治療效果呈劑量依賴性(圖5f,g)。這些數(shù)據(jù)綜合表明,融合到外泌體中的PLXNA1截短片段的POIs保持了甚至比重組POIs更強(qiáng)的活性。
 

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圖5. 融合PLXNA1截短體的POIs活性評估

五、基于ALFAtag/NbALFA的通用外泌體平臺
研究者構(gòu)建了一個基于ALFAtag/NbALFA系統(tǒng)的通用外泌體平臺(圖6a)。通過將NbALFA納米抗體融合表達(dá)在PLXNA1的N端,實現(xiàn)了帶有ALFAtag標(biāo)簽的重組蛋白與外泌體的高效結(jié)合。這種標(biāo)記方法不僅效率高(圖6b,c),也不影響POIs的活性(圖6d)。此外,研究者還評估外泌體的保存過程中的穩(wěn)定,結(jié)果表明基于NbALFA/ALFA系統(tǒng)的工程外泌體可以抵抗至少三次凍融,且能夠在多個條件下長時間穩(wěn)定保存(圖6e,f)。由此說明,這種NbALFA/ALFA系統(tǒng)是一種高度通用和穩(wěn)定的外泌體工程技術(shù)。

 

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圖6. 基于ALFAtag/NbALFA系統(tǒng)的通用外泌體平臺的評估


研究意義
該項研究對外泌體支架蛋白的篩選條件進(jìn)行了修訂和拓展,為外泌體遞送系統(tǒng)的開發(fā)帶來了更多的可能性,且篩選得到的支架蛋白PLXNA1并在對其進(jìn)行截斷改造的基礎(chǔ)上實現(xiàn)了高表達(dá)、高活性、高遞送能力和高穩(wěn)定性的工程化外泌體。此外,恩澤康泰構(gòu)建的通用型外泌體開發(fā)平臺ALFAtag/NbALFA,為工程化外泌體后續(xù)作為藥物載體的應(yīng)用潛力提供了有力證明。該研究成果標(biāo)志著外泌體技術(shù)在藥物遞送和基因治療領(lǐng)域邁出了重要的一步,推動了工程化外泌體未來的臨床應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化。


展望
NanoFCM不僅可對EVs的顆粒濃度、粒徑分布、載藥量、蛋白、核酸等物理生化性質(zhì)進(jìn)行分析,還對EVs的生產(chǎn)過程進(jìn)行質(zhì)量控制,優(yōu)化生產(chǎn)條件、提高載藥效率。同時可對EVs在生產(chǎn)后的穩(wěn)定性進(jìn)行評價,評估不同存儲條件對EVs的影響。NanoFCM的應(yīng)用貫穿整個EVs制劑研發(fā)、大規(guī)模生產(chǎn)、分離純化、質(zhì)控、穩(wěn)定性評估等整個過程,極大加速EVs產(chǎn)品研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程!

來源:廈門福流生物科技有限公司
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