作者：Biotech 文章來源：Biotech share

在生物制藥行業(yè)日益競爭激烈的背景下，快速、高效地生產(chǎn)重組蛋白已成為決定企業(yè)成敗的關(guān)鍵。哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)基因表達(dá)系統(tǒng)(TGE)以其周期短、操作簡便等優(yōu)勢，成為重組蛋白生產(chǎn)的核心技術(shù)之一。然而，提升TGE的表達(dá)效率和穩(wěn)定性仍是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。

本文深入分析了TGE系統(tǒng)的最新改進(jìn)策略，包括細(xì)胞系優(yōu)化、表達(dá)載體設(shè)計(jì)、培養(yǎng)基改進(jìn)和共表達(dá)輔助基因的應(yīng)用，為生物制藥研發(fā)提供了切實(shí)可行的優(yōu)化方案，展示了該技術(shù)在推動(dòng)生物制藥產(chǎn)業(yè)化中的巨大潛力。

前言

重組治療蛋白（包括抗體）的生產(chǎn)是生物制藥領(lǐng)域的核心組成部分，其表達(dá)系統(tǒng)涵蓋了細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和植物等多種形式。其中，常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)包括中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）、小鼠骨髓瘤細(xì)胞（NS0和Sp2/0）以及人胚胎腎293細(xì)胞（HEK293）。在2014至2018年期間，CHO細(xì)胞仍然是最常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。數(shù)據(jù)顯示，在通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的107種產(chǎn)品中，有95種（即89%）是使用CHO細(xì)胞生產(chǎn)的，其次是HEK293細(xì)胞。CHO細(xì)胞不僅能夠生產(chǎn)具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，還具有大規(guī)模培養(yǎng)的能力，并且對病毒感染具有較強(qiáng)的抵御能力。HEK293細(xì)胞則以其在無血清懸浮培養(yǎng)中易于生長和快速繁殖的特點(diǎn)著稱，且在使用常見的轉(zhuǎn)染試劑時(shí)表現(xiàn)出高效的轉(zhuǎn)染能力，因此在藥物發(fā)現(xiàn)和毒性測試中被廣泛應(yīng)用。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)主要分為兩種方式：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)（TGE）和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)（SGE）。TGE相比SGE具有更快的啟動(dòng)過程，不需要繁瑣的篩選步驟，目的基因（GOI）可以直接轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞（圖1），快速實(shí)現(xiàn)蛋白表達(dá)。然而，TGE系統(tǒng)的產(chǎn)量通常低于SGE，這也是限制大規(guī)模TGE應(yīng)用的主要瓶頸。為了提高TGE的產(chǎn)量和效率，主要改進(jìn)策略集中在優(yōu)化各個(gè)環(huán)節(jié)，包括表達(dá)載體的設(shè)計(jì)、轉(zhuǎn)染方法的選擇、轉(zhuǎn)染條件的調(diào)整、培養(yǎng)工藝的優(yōu)化、培養(yǎng)基的改進(jìn)以及細(xì)胞系的改良。本文將對TGE系統(tǒng)及其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中的最新改進(jìn)策略進(jìn)行詳細(xì)綜述和分析。

宿主細(xì)胞系

通過瞬時(shí)基因表達(dá)（TGE）在這些哺乳動(dòng)物細(xì)胞中快速生產(chǎn)重組蛋白是生物制藥開發(fā)早期階段中的重要工具。TGE系統(tǒng)主要由表達(dá)載體、細(xì)胞系和培養(yǎng)基組成，每個(gè)組成部分在高效蛋白質(zhì)生產(chǎn)中都扮演著至關(guān)重要的角色。

◉CHO細(xì)胞：蛋白表達(dá)量的高低主要取決于基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，宿主細(xì)胞可以通過不同途徑調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，來影響蛋白的表達(dá)量。在TGE系統(tǒng)中，最常用的宿主細(xì)胞系是HEK293細(xì)胞和CHO細(xì)胞。CHO細(xì)胞來源于中國倉鼠的雌性卵巢組織，由于其在重組蛋白生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，研究人員已分離出多個(gè)CHO細(xì)胞的亞型，并對其進(jìn)行了不同方向的開發(fā)。這些亞型包括CHO-S、CHO-K1、CHO-DXB11、CHO-DG44、CHO-M以及GS敲除的CHO細(xì)胞。每種亞型都具備不同的基因型和表型特性，適應(yīng)不同的生產(chǎn)需求。目前，重組蛋白生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的CHO細(xì)胞系主要有CHO-K1、CHO-DXB11和CHO-DG44三種。在選擇合適的CHO宿主細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)生產(chǎn)時(shí)，關(guān)鍵是根據(jù)特定需求選擇具有最佳特性的表達(dá)系統(tǒng)或細(xì)胞系。以下是常見CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和細(xì)胞系的特點(diǎn)總結(jié)（表1）。

表1 瞬時(shí)表達(dá)用CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和細(xì)胞系的特征細(xì)胞系

	細(xì)胞系特征	優(yōu)勢
CHO-K1細(xì)胞	最早分離的CHO細(xì)胞，適應(yīng)性強(qiáng)，生長快速	適合基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)和重組蛋白的表達(dá)
CHO-S細(xì)胞	用于懸浮培養(yǎng)，增殖速度快	對培養(yǎng)基成分有良好的適應(yīng)性，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
CHO-DG44細(xì)胞	缺乏二氫葉酸還原酶（DHFR）	便于建立穩(wěn)定細(xì)胞株，適合長時(shí)間重組蛋白生產(chǎn)。
CHO-EBNA細(xì)胞	可維持重組基因的長期表達(dá)	高效且適合持續(xù)生產(chǎn)，表現(xiàn)出良好的蛋白表達(dá)能力。
CHO-S(EBNA)細(xì)胞	結(jié)合了CHO-S細(xì)胞和EBNA的優(yōu)點(diǎn)	適合快速實(shí)驗(yàn)需求，表現(xiàn)出良好的蛋白表達(dá)和分泌能力。

◉HEK293細(xì)胞：HEK293細(xì)胞系及其亞型（293E、293T、293F）也是一種廣泛應(yīng)用于瞬時(shí)基因的表達(dá)系統(tǒng)，具有基因操作簡便、高轉(zhuǎn)染效率、無血清懸浮培養(yǎng)下實(shí)現(xiàn)高密度生長等優(yōu)勢。然而，其在N-聚糖結(jié)構(gòu)差異、臨床應(yīng)用受限及易受病毒污染等方面存在局限性。通過優(yōu)化糖基化修飾、加強(qiáng)病毒污染控制和合理選擇亞型，可以提升其蛋白質(zhì)生產(chǎn)效率與質(zhì)量。

◉表達(dá)載體：表達(dá)載體是瞬時(shí)基因表達(dá)（TGE）系統(tǒng)的重要組成部分，負(fù)責(zé)攜帶目標(biāo)基因進(jìn)入宿主細(xì)胞，并調(diào)控其表達(dá)，包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子和選擇標(biāo)記等調(diào)控元件。不同的調(diào)控元件組合會(huì)影響基因表達(dá)效率和重組蛋白的產(chǎn)量（表2）。

表2 TGE系統(tǒng)中的關(guān)鍵調(diào)控元件總結(jié)調(diào)控

元件	作用	常見示例	影響
啟動(dòng)子	決定基因轉(zhuǎn)錄的起始效率，調(diào)控基因表達(dá)的強(qiáng)度	CMV、EF1α、SV40、SCP	超級(jí)核心啟動(dòng)子能夠增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄活性，提高目的蛋白表達(dá)及其穩(wěn)定性
增強(qiáng)子	協(xié)助啟動(dòng)子增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率，提升基因表達(dá)的量	SV40 enhancerCMV enhancer	增強(qiáng)基因表達(dá)，增加轉(zhuǎn)錄效率
終止子	終止轉(zhuǎn)錄并確保mRNA穩(wěn)定性，影響mRNA的壽命與轉(zhuǎn)運(yùn)	BGH Poly(A)SV40 Poly(A)	提高mRNA穩(wěn)定性，間接增強(qiáng)蛋白表達(dá)
選擇標(biāo)記	篩選成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，確保目標(biāo)蛋白的有效表達(dá)	Neo、Puro、GFP	確保篩選陽性細(xì)胞群，提高表達(dá)的純度
復(fù)制元件	提供質(zhì)粒復(fù)制功能，增強(qiáng)外源基因的表達(dá)持續(xù)性	oriP（與EBNA-1蛋白結(jié)合）、SV40 ori（與大T抗原結(jié)合）	延長質(zhì)粒在細(xì)胞中的維持時(shí)間，提升蛋白產(chǎn)量

◉細(xì)胞培養(yǎng)基：細(xì)胞培養(yǎng)基為細(xì)胞的生長和蛋白表達(dá)提供必要的營養(yǎng)，是確保高效表達(dá)重組蛋白的關(guān)鍵因素。安全、有效的培養(yǎng)基不僅能夠提高蛋白產(chǎn)量，還能簡化下游的純化過程。傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)常需在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10-20%的血清，以維持細(xì)胞生長。然而，血清在不同批次中的差異、其易受支原體污染，以及其復(fù)雜的蛋白質(zhì)成分，都會(huì)增加后續(xù)蛋白分離和純化的難度。

◉SFM：為克服這些局限，無血清培養(yǎng)基（SFM）成為理想替代方案。SFM由明確的血清替代成分和基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成，減少了血清對細(xì)胞培養(yǎng)的影響。這不僅能夠使下游的分離和純化過程更為簡便，同時(shí)降低了生產(chǎn)成本，提高了工藝的一致性和安全性。因此，SFM在工業(yè)化蛋白生產(chǎn)中具有顯著優(yōu)勢，有助于簡化流程并提升重組蛋白的質(zhì)量。瞬時(shí)基因表達(dá)改

細(xì)胞系改造

細(xì)胞系的改造主要通過提高轉(zhuǎn)染效率、引入抗凋亡基因、過表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白以優(yōu)化蛋白折疊和分泌、調(diào)整糖基化修飾、以及調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝途徑來提升蛋白質(zhì)生產(chǎn)的效率、產(chǎn)量和質(zhì)量。這些改造方法廣泛應(yīng)用于CHO和HEK293等細(xì)胞系中，Macaraeg等在CHO-K1細(xì)胞中敲除了兩個(gè)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因Bax和Bak，構(gòu)建了雙敲除（DKO）細(xì)胞，DKO細(xì)胞所表達(dá)的抗體產(chǎn)量比對照組高出3至4倍。Major等構(gòu)建的Bcl-xL細(xì)胞系在14天的批次培養(yǎng)后，融合蛋白的產(chǎn)量增加了70%至270%，細(xì)胞活力維持在90%以上，且凋亡率降低。Zhong等的研究顯示，ExpiCHO-S™ TGE系統(tǒng)能夠產(chǎn)生高水平的重組抗體，與其他系統(tǒng)相比具有顯著的表達(dá)產(chǎn)量提升，同時(shí)具有所需的轉(zhuǎn)錄后修飾（PTMs）。Chen等的研究中，人類17β-羥基類固醇脫氫酶1在HEK293T細(xì)胞中通過TGE得到了高水平表達(dá)，經(jīng)過72小時(shí)的轉(zhuǎn)染后達(dá)到了17mg/L的最高表達(dá)水平。Jäger等進(jìn)一步優(yōu)化了HEK293細(xì)胞中的單鏈可變區(qū)抗體（scFv Fc）的TGE系統(tǒng)，達(dá)到了10-20mg/L的抗體表達(dá)產(chǎn)量。為了進(jìn)一步提升產(chǎn)量，研究者使用了帶有EBNA-1截短變體的HEK293-6E懸浮細(xì)胞。這種改進(jìn)極大提高了抗體的體積產(chǎn)量，使產(chǎn)量增加了10倍，達(dá)到140mg/L。

表達(dá)載體工程

瞬時(shí)基因表達(dá)載體工程是設(shè)計(jì)和構(gòu)建質(zhì)粒載體以促進(jìn)目標(biāo)基因在宿主細(xì)胞中短時(shí)間內(nèi)高效表達(dá)的過程。通過優(yōu)化表達(dá)載體的組成元件，可以提高瞬時(shí)基因表達(dá)（TGE）的效率和產(chǎn)量。

➣啟動(dòng)子：啟動(dòng)子是可以被RNA聚合酶特異性識(shí)別并結(jié)合的DNA調(diào)控序列，從而有效啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。人類巨細(xì)胞病毒（hCMV）的即早期啟動(dòng)子是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)重組蛋白表達(dá)的常用的啟動(dòng)子。Jostock等研究指出，在HEK293T細(xì)胞中，由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的IRES介導(dǎo)的雙順反子載體能夠?qū)崿F(xiàn)平均IgG瞬時(shí)表達(dá)量超過10μg/mL。進(jìn)一步的研究表明，采用相同CMV啟動(dòng)子的雙啟動(dòng)子載體系統(tǒng)的抗體滴度達(dá)到最高，分別比雙順反子和雙載體系統(tǒng)提高了1.4倍和1.9倍。此外，Yang等構(gòu)建了雙順反子、單順反子和雙啟動(dòng)子載體，并在CHO細(xì)胞中進(jìn)行了瞬時(shí)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)雙啟動(dòng)子載體在CHO細(xì)胞中的表達(dá)量最高，達(dá)約18 ± 4μg/mL。這些研究結(jié)果表明，雙啟動(dòng)子策略在提高重組抗體產(chǎn)量上更具優(yōu)勢，主要機(jī)制可能在于重鏈（HC）和輕鏈（LC）基因通過不同啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)了更高的轉(zhuǎn)錄獨(dú)立性和表達(dá)靈活性，從而增強(qiáng)了抗體的瞬時(shí)表達(dá)效率。

Poulain等研究指出，在累麥基因開關(guān)啟動(dòng)子（CR5）的驅(qū)動(dòng)下，重組蛋白的體積產(chǎn)量顯著提升，比CMV啟動(dòng)子或雜合EF-1α-HTLV組成啟動(dòng)子的表達(dá)量高出三到四倍，此結(jié)果表明CR5啟動(dòng)子在蛋白質(zhì)表達(dá)中具有顯著優(yōu)勢。Brown等的研究則表明，通過抑制YY1轉(zhuǎn)錄抑制因子的活性，分泌型堿性磷酸酶（SEAP）的產(chǎn)量可增加1.5倍，這一發(fā)現(xiàn)表明，通過調(diào)控CMV啟動(dòng)子來優(yōu)化CHO細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)（TGE）可以增加重組蛋白的生產(chǎn)效率。另外，Gupta等通過轉(zhuǎn)染密碼子優(yōu)化的酵母細(xì)胞質(zhì)丙酮酸羧化酶（PYC2）和使用強(qiáng)效融合啟動(dòng)子，顯著提升了PYC2酶的表達(dá)水平，使單mAb的產(chǎn)量提高了5％，同時(shí)顯著提升了糖基化的產(chǎn)物質(zhì)量，甘露糖化水平提高了兩倍，半乳糖化水平提高了2.5倍。這些研究結(jié)果表明，通過啟動(dòng)子選擇、轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控和基因優(yōu)化，可以實(shí)現(xiàn)重組蛋白表達(dá)和質(zhì)量的顯著改善。

➣順式元件：順式元件是通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄效率和穩(wěn)定性，在載體工程中起到重要作用的遺傳元件。常見的順式元件包括基因座控制區(qū)（LCR）、核基質(zhì)附著區(qū)（MAR）和普遍染色質(zhì)開啟元件（UCOE）。其中，UCOE是CpG島中未甲基化的基因啟動(dòng)子，通過防止轉(zhuǎn)染過程中DNA甲基化引起的沉默效應(yīng)，有助于維持高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。Nematpour等的研究表明，UCOE能夠提高細(xì)胞系的抗體產(chǎn)量，特別是與重鏈結(jié)合使用時(shí)，其穩(wěn)定性更好，能夠進(jìn)一步提升單克隆抗體的產(chǎn)量。

MAR則是另一種重要的順式元件，它作為表觀遺傳調(diào)控因子，通過與核基質(zhì)特異性結(jié)合，參與基因表達(dá)的調(diào)控過程。相比沒有MAR的對照載體，含有MAR的質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞時(shí)，能夠顯著提高重組蛋白的表達(dá)水平。LCR則是調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)的核心元件之一，研究表明，LCR通過慢病毒載體能有效增強(qiáng)抗體的滴度和基因轉(zhuǎn)移效率。此外，Mariati等研究了五種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元素（PTREs），包括熱休克蛋白70（Hsp70）、163bp長剪接變體（SP163）、與主要晚期啟動(dòng)子增強(qiáng)子（TM）連接的人腺病毒mRNA的三部分首碼序列、內(nèi)含子A以及野鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元素（WPRE）。結(jié)果顯示，TM能夠提供最高的基因表達(dá)水平，使表達(dá)水平提高了3.6到7.6倍。

其他PTREs元素也能顯著提高蛋白表達(dá)水平，幅度為1.7到3.2倍。而多種PTREs的組合則進(jìn)一步使重組蛋白的表達(dá)增加至10.5倍，特別是WPRE與內(nèi)含子A、SP163或TM的組合具有疊加效應(yīng)。

➣信號(hào)肽的優(yōu)化：信號(hào)肽的優(yōu)化是提高重組蛋白分泌效率的重要策略。Kober等人通過對16種不同信號(hào)肽的效果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)來自人血清白蛋白和嗜中性粒細(xì)胞特異性蛋白（azurocidin）的信號(hào)肽效果最佳。進(jìn)一步的補(bǔ)料批次分析驗(yàn)證了這些結(jié)果，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞池中，使用這些信號(hào)肽可以實(shí)現(xiàn)高達(dá)90pg/cell/day的細(xì)胞特異性產(chǎn)量，且使用白蛋白信號(hào)肽的抗體產(chǎn)量達(dá)到4g/L。然而，最合適的信號(hào)肽選擇可能因蛋白質(zhì)種類而異。

Haryadi等人研究了兩個(gè)κ輕鏈信號(hào)肽（L1和L2）和八個(gè)重鏈信號(hào)肽（H1–H8）在五種不同抗體生產(chǎn)中的表現(xiàn)。結(jié)果表明，不同抗體的最佳信號(hào)肽組合并不一致。例如，Avastin、Herceptin、Rituxan、Remicade和Humira的最佳信號(hào)肽組合分別為H7/L1、H5/L1、H7/L2、H7/L2和H7/L1。這些研究表明，信號(hào)肽的優(yōu)化需要根據(jù)每種抗體的特性進(jìn)行具體分析。O’Neill等人則使用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)設(shè)計(jì)合成信號(hào)肽，并評估其對三種不同重組蛋白的表達(dá)效果。這三種蛋白包括一個(gè)單鏈變體融合蛋白、一個(gè)易于表達(dá)的單克隆抗體（ETE），以及一個(gè)難以表達(dá)的單克隆抗體（DTE）。研究顯示，最優(yōu)信號(hào)肽方案具有高度的蛋白質(zhì)特異性，能夠分別將ETE輕鏈、DTE輕鏈和單鏈變體融合蛋白的產(chǎn)量提高1.8倍、2.5倍和2.7倍。這表明，信號(hào)肽的選擇與目標(biāo)蛋白質(zhì)的特性密切相關(guān)，優(yōu)化信號(hào)肽能夠顯著提高重組蛋白的分泌效率。

培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化

培養(yǎng)基添加物

培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化是提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞中重組蛋白表達(dá)的重要手段。蛋白胨作為一種富含肽、氨基酸和無機(jī)鹽的水溶性蛋白水解物，能夠顯著改善細(xì)胞培養(yǎng)效果。Davami等通過將蛋白胨添加到無血清培養(yǎng)基中，顯著提升了HEK293-EBNA細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)（TGE）的產(chǎn)量，并使CHO細(xì)胞的體積生產(chǎn)力提高了37%。類似地，Burteau等的研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充小麥蛋白胨使細(xì)胞生長增加了30%，同時(shí)干擾素-γ（IFN-γ）的生產(chǎn)提高了60%，這表明植物來源的蛋白胨不僅能夠提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長，還能增強(qiáng)產(chǎn)品產(chǎn)量。Ye等研究通過在批次培養(yǎng)中補(bǔ)充二甲基亞砜（DMSO）和乙酸鋰（LiAc）對CHO細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的影響，結(jié)果表明這些添加物顯著提高了IgG的生產(chǎn)，最終產(chǎn)量達(dá)到80mg/L。類似的研究中，Lynch等發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染后4小時(shí)向HEK293細(xì)胞培養(yǎng)基中添加10%的DMSO，能夠?qū)⒅亟M蛋白的表達(dá)水平提高約1.6倍，同時(shí)未觀察到顯著的細(xì)胞毒性。此外，伴侶蛋白在重組蛋白生產(chǎn)過程中扮演著重要角色，能夠輔助蛋白質(zhì)正確折疊并防止蛋白聚集。DMSO在蛋白折疊途徑中表現(xiàn)出伴侶蛋白樣的功能，減少了蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象，進(jìn)而提高了生產(chǎn)效率。

降溫策略

在工業(yè)生產(chǎn)中，降溫策略被廣泛用于提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞中重組蛋白的產(chǎn)量。通常，哺乳動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)初期保持在37℃的標(biāo)準(zhǔn)溫度下，以促進(jìn)細(xì)胞快速生長和增殖。隨著培養(yǎng)進(jìn)入生長抑制階段，溫度通常會(huì)降低至31℃或33℃，以優(yōu)化蛋白質(zhì)生產(chǎn)。Lin等發(fā)現(xiàn)，通過將培養(yǎng)溫度降至33℃，雖然降低了HEK293S細(xì)胞的生長速率，但綠色熒光蛋白（GFP）和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（AMPA）受體的表達(dá)顯著增加了約1.5倍。降溫通過使細(xì)胞在G1/G0期停滯并抑制細(xì)胞凋亡，從而提高了重組蛋白的產(chǎn)量，并增強(qiáng)了細(xì)胞活力。同時(shí)，降溫還能提高與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊和加工相關(guān)的基因（如ddit3、atfx、bp1s5、grp78、trib3、grp94和ero1α）的表達(dá)，這些基因調(diào)控未折疊蛋白反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白的產(chǎn)生，從而改善蛋白質(zhì)加工和分泌。

Sou等研究表明，將培養(yǎng)溫度降至32℃進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)（TGE）相比于在36.5℃條件下培養(yǎng)，能使產(chǎn)量的qP提高76%。這一增幅伴隨著氨基酸和營養(yǎng)物質(zhì)的消耗增加，同時(shí)核苷糖種類的產(chǎn)量也有所增加，重組單克隆抗體的半乳糖化速率顯著提高。Zhang等提出，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模生產(chǎn)過程中，可以在懸浮培養(yǎng)的第3天將溫度降至33℃，以提高治療蛋白的產(chǎn)量。

此外，Barron等的研究表明，降溫可調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)，六種miRNA（mir-219、mir-518d、mir-126、mir-30e、mir-489和mir-345）在降溫下顯著上調(diào)，而四種miRNA（mir-7、mir-320、mir-101和mir-199）則下調(diào)。這些miRNA的表達(dá)變化與重組蛋白生產(chǎn)的增強(qiáng)密切相關(guān)。Fischer等發(fā)現(xiàn)，miR-30e的過表達(dá)能夠使CHO細(xì)胞中分泌型堿性磷酸酶（SEAP）的產(chǎn)量提高約兩倍。而在CEVEC的羊膜細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)中，miR-136、miR-3074和miR-219的過表達(dá)顯著提高了單克隆抗體的最終濃度。Sanchez等的研究進(jìn)一步表明，抑制miR-7幾乎使CHO細(xì)胞中SEAP的產(chǎn)量翻倍。這些結(jié)果表明，降溫策略不僅通過調(diào)控細(xì)胞周期和蛋白折疊途徑增強(qiáng)蛋白表達(dá)，還通過miRNA的調(diào)節(jié)機(jī)制顯著提高了重組蛋白的生產(chǎn)效率。

轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化

合適的聚合物

轉(zhuǎn)染的每個(gè)步驟對最終結(jié)果都有不同程度的影響，因此優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件至關(guān)重要。通過選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑、調(diào)整DNA和試劑的用量、控制細(xì)胞密度，可以提高轉(zhuǎn)染效率和重組蛋白的產(chǎn)量。優(yōu)化后的轉(zhuǎn)染方案應(yīng)具備操作簡便、成本低、流程短、效率高的特點(diǎn)，以滿足高效生產(chǎn)的需求，并在保持產(chǎn)量的同時(shí)確保產(chǎn)品質(zhì)量。

Daramola等使用陽離子脂質(zhì)基試劑對CHO-S細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，在1L搖瓶批量培養(yǎng)中獲得了60mg/L的重組IgG。Kadlecova等研究了一種新型轉(zhuǎn)染試劑-超支化聚賴氨酸（HBPL），發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)染效果與傳統(tǒng)的PEI或Fugene1相當(dāng)，甚至在某些情況下更高。HBPL具有不需要復(fù)雜預(yù)孵育、適用于含血清培養(yǎng)基且可生物降解的優(yōu)勢，從而降低了細(xì)胞毒性并簡化了下游處理流程。Delafosse等則發(fā)現(xiàn)，使用去�；�的PEI “Max”和PEIpro™相比于常規(guī)PEI，能夠顯著提高重組蛋白的表達(dá)水平。這些研究表明，選擇最合適的聚合物對優(yōu)化瞬時(shí)基因表達(dá)（TGE）系統(tǒng)非常重要。

添加比例

de Los Milagros Bassani Molinas等開發(fā)了一種完全無血清的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法，采用不含鈣的DMEM和FreeStyle™ 293表達(dá)培養(yǎng)基的1:1混合物，通過優(yōu)化DNA和PEI的比例（1:3），在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)內(nèi)達(dá)到最大轉(zhuǎn)染效率（70-96%），并獲得1.6 μg/mL的重組人促紅細(xì)胞生成素。Johari等設(shè)計(jì)了一種脂質(zhì)體介導(dǎo)的雙相SP35Fc特異性TGE過程，利用免疫抑制因子CYPB共表達(dá)來最大化產(chǎn)量，并通過最佳比例（5:1）消除SP35Fc的聚集，從而將產(chǎn)量提高了六倍，同時(shí)避免了二硫鍵聚集體的形成。此外，苯環(huán)醇（DNA聚合酶抑制劑）與丁酸鹽（組蛋白去乙�；�酶抑制劑）的聯(lián)合預(yù)處理，通過電穿孔顯著增加了熒光強(qiáng)度。在CHO細(xì)胞中熒光強(qiáng)度增加了4.8倍，在HEK293細(xì)胞中增加了2.8倍，而在HEK293-EBNA細(xì)胞中則增加了1.9倍。這些優(yōu)化方法表明，通過調(diào)整不同的轉(zhuǎn)染條件，可以大幅提高瞬時(shí)基因表達(dá)的效率和蛋白質(zhì)產(chǎn)量。

通過優(yōu)化DNA（N）與PEI（P）的比率，可以顯著提高轉(zhuǎn)染效率和重組蛋白的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DNA/PEI（w/w）比率為1:3時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高，范圍在60%到66.93%之間。此外，Rajendra等研究表明，使用非特異性填充DNA來替代部分編碼DNA時(shí)，盡管編碼DNA量減少67%，重組蛋白的生產(chǎn)仍與對照組相當(dāng)。填充DNA不會(huì)影響編碼DNA的細(xì)胞攝取或穩(wěn)定性，反而增加了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的比例和轉(zhuǎn)基因mRNA的穩(wěn)定性。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的優(yōu)化還需要考慮多種因素，包括培養(yǎng)基類型、懸浮細(xì)胞密度、質(zhì)粒DNA和PEI的用量。Haldankar等人通過優(yōu)化這些轉(zhuǎn)染參數(shù)，獲得了高達(dá)9.4mg/L的重組蛋白表達(dá)水平。Liu等使用陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑FreeStyle™ MAX對HEK293和CHO細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通過優(yōu)化參數(shù)，獲得了約70%的eGFP陽性細(xì)胞和50–80mg/L的IgG抗體分泌。轉(zhuǎn)染系統(tǒng)擴(kuò)大到1L時(shí)，保持了相似的轉(zhuǎn)染效率和蛋白產(chǎn)量，并提高了人紅細(xì)胞生成素和凝血因子IX的表達(dá)。

此外，在HEK293T細(xì)胞系中，對質(zhì)粒DNA進(jìn)行72°C加熱處理30分鐘顯著提高了轉(zhuǎn)染效率。González-Domínguez等通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DoE）優(yōu)化了轉(zhuǎn)染參數(shù)，發(fā)現(xiàn)在NaCl濃度為125mM和孵育時(shí)間為11分鐘的條件下，獲得了最高的轉(zhuǎn)染產(chǎn)量。這些研究表明，通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，可以顯著提升重組蛋白的表達(dá)效率和產(chǎn)量。

共表達(dá)調(diào)節(jié)蛋白

X-box結(jié)合蛋白

調(diào)節(jié)蛋白的共表達(dá)對細(xì)胞生長和重組蛋白的表達(dá)起到了顯著的促進(jìn)作用。Rajendra等人的研究表明，過表達(dá)X-box結(jié)合蛋白（XBP-1S）能夠使CHO細(xì)胞中幾種治療蛋白的產(chǎn)量增加15%至85%。此外，Cain等發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)XBP-1S和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶（ERO1-La）的CHO-S細(xì)胞系相比對照組，其抗體產(chǎn)量增加了5.3至6.2倍。

miRNA

某些miRNA的共表達(dá)也可以提高重組蛋白的產(chǎn)量。Jadhav等人通過miRNA篩選發(fā)現(xiàn)，miR-17能夠促進(jìn)CHO細(xì)胞的生長并提高蛋白生產(chǎn)力。Ohsfeldt等人的研究顯示，過表達(dá)Bcl-xL基因的CHO細(xì)胞在轉(zhuǎn)染表皮生長因子受體或成纖維生長因子受體3后，重組蛋白的表達(dá)量顯著增加，證明Bcl-xL的共表達(dá)可以提高蛋白產(chǎn)量。Zustiak等也發(fā)現(xiàn)，Bcl-xL共轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞凋亡率降低，特異生產(chǎn)力提高，重組蛋白產(chǎn)量增加了約100%。

其它調(diào)節(jié)因子

此外，Budge等人發(fā)現(xiàn)，核苷酸二磷酸激酶A（NDPK-A）的共表達(dá)提高了CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，并且當(dāng)NDPK-A與EBNA-1結(jié)合時(shí)，重組蛋白的瞬時(shí)表達(dá)顯著增加。Lee等人通過建立共表達(dá)EBNA-1和多瘤病毒大T抗原（PyLT）的CHO細(xì)胞，顯著提高了Fc-融合蛋白的表達(dá)量，qP比對照細(xì)胞高出22.9倍。Daramola等的研究也表明，EBNA-1與GS的共表達(dá)增強(qiáng)了CHO細(xì)胞中重組抗體的瞬時(shí)基因表達(dá)。

Roobol等人發(fā)現(xiàn)，瞬時(shí)過表達(dá)真核起始因子3（eIF3i）復(fù)合物可提高CHO-K1細(xì)胞中整體蛋白的合成速率約10%。此外，Vink等人描述了一種基于快速生長懸浮細(xì)胞系FreeStyle™ 293-F的優(yōu)化系統(tǒng)，通過與表達(dá)增強(qiáng)質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染，在不到一周內(nèi)獲得了高達(dá)400 mg/L的分泌抗體產(chǎn)量。這些研究表明，通過調(diào)節(jié)蛋白的共表達(dá)，能夠顯著改善重組蛋白的生產(chǎn)效率。

小結(jié)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞的瞬時(shí)基因表達(dá)（TGE）系統(tǒng)以其周期短、操作簡單的優(yōu)勢，成為重組蛋白生產(chǎn)的重要平臺(tái)，尤其適用于初步研究和快速篩選。TGE系統(tǒng)的核心組成包括細(xì)胞系、表達(dá)載體和培養(yǎng)基。通過細(xì)胞系的改造、載體工程的優(yōu)化、轉(zhuǎn)染條件的篩選，以及培養(yǎng)基配方和工藝流程的改進(jìn)，TGE系統(tǒng)生成的重組蛋白的表達(dá)水平和質(zhì)量得到了顯著提升。此外，共表達(dá)輔助基因，如XBP-1S、Bcl-xL等，進(jìn)一步增強(qiáng)了蛋白的合成和分泌效率。

然而，盡管TGE系統(tǒng)具備多項(xiàng)優(yōu)勢，重組蛋白的表達(dá)仍然受到批次間差異、轉(zhuǎn)染效率波動(dòng)等因素的影響，導(dǎo)致表達(dá)水平有待進(jìn)一步提升。隨著組學(xué)技術(shù)（如基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等）的發(fā)展，以及數(shù)據(jù)分析技術(shù)和人工智能的融合，更加精準(zhǔn)、高效的TGE系統(tǒng)將為工業(yè)化重組蛋白的生產(chǎn)提供更可靠的解決方案。這些新興技術(shù)將推動(dòng)TGE系統(tǒng)在大規(guī)模生產(chǎn)中更廣泛的應(yīng)用，從而滿足生物制藥和研究領(lǐng)域?qū)Ω咝У鞍咨�產(chǎn)的需求。

參考文獻(xiàn)：

[1]Fu Y , Han Z , Cheng W ,et al.Improvement strategies for transient gene expression in mammalian cells[J].Applied Microbiology & Biotechnology, 2024, 108(1).DOI:10.1007/s00253-024-13315-y.

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