Biomarkers是進行疾病篩查、預后和治療監(jiān)測的有效檢測指標，其檢測通常依賴于高靈敏度和高特異性的功能性納米探針（例如標記抗體或功能肽）。理想的功能性納米探針應具有較高的結合親和力、較低的生產(chǎn)成本以及易于進行大規(guī)模生產(chǎn)和存儲等優(yōu)勢，這對于流行性疾病的快速篩查尤為重要。目前雖然已有多種策略可以將生物分子（如抗體）精確地附著到材料上以提高探針的靶向親和性，但仍存在偶聯(lián)效率低、位點特異性差和靶點結合效率低下等問題，功能性探針要實現(xiàn)廣泛的應用仍然極具挑戰(zhàn)性。

來自澳大利亞昆士蘭大學的研究團隊開發(fā)了一種高性價比且制作簡便的多功能納米探針模型，可用于疾病快速篩查，該成果發(fā)表在Nature Nanotechnology上。此研究團隊將探針命名為synthetic bionanofragments (SynBioNFs)。SynBioNFs是基于工程化酵母菌衍生的合成生物納米片段，通過基因工程改造使其擁有多功能組分，包括內源性的特定目標結合劑（納米抗體）和通用表面粘合劑（粘附肽），研究證明SynBioNFs可在包括表面增強拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering, SERS)、熒光、電化學、比色側向層析(colorimetric lateral flow assay, LFA)等多種檢測平臺捕獲并檢測SARS-CoV-2病毒(SCV2)，其靈敏度可與金標準方法RT-qPCR相媲美。該探針模型能實現(xiàn)生物標志物的高效檢測，有望應用于大流行性疾病篩查。
 

一、SynBioNFs的結構特征及優(yōu)勢性能
SynBioNFs本質是基因工程改造的酵母菌超聲破碎后的細胞壁碎片（納米探針顆粒）。SynBioNFs模型為以酵母菌細胞壁蛋白Aga2p為骨架，分別在N端和C端連接多功能蛋白/肽成分，超聲破碎后純化得到同時擁有特異性結合位點和通用的表面結合劑的納米探針Targeting binder-Aga2p (anchor protein)-Surface binder（圖1）。

與市售的生物標志物檢測抗體相比，SynBioNFs包含酵母細胞壁中豐富的多糖羥基（能增強功能蛋白的穩(wěn)定性），在高溫、低pH和強洗滌劑條件下具有更高的穩(wěn)定性；同時得益于工程化的改造，SynBioNFs對目標蛋白也表現(xiàn)出更強的親和能力。因此，不管是從制備難易程度還是穩(wěn)定性、親和性等層面評估，SynBioNFs都具有優(yōu)良的生物標志物檢測特性。

為驗證SynBioNFs在SCV2檢測中的功能，作者選用SCV2受體結合域(SCV2 receptor-binding-domain, SCV2 RBD)作為靶標結合劑，MatterTags11、SpyTags和 StrepTags3種常見的功能肽作為表面結合劑，并結合表面增強拉曼散射(SERS)、電化學(Electrochemical)、熒光、比色等方法對SynBioNFs的診斷能力進行評估，證明了SynBioNFs的精準靶向性和在不同檢測平臺的通用性。
 

圖1. SynBioNFs設計技術路徑

二、SynBioNFs的制備和表征
將W25-MatterTag（靶標結合劑）、Sb68-SpyTag（表面結合劑）分別連接在Aga2p（錨定蛋白）N端和C端制備重組質粒后導入酵母菌。經(jīng)過培養(yǎng)的工程化酵母菌使用anti-myc-Dy650熒光抗體和SCV2 RBD–mNeonGreen進行標記，并利用流式細胞術對酵母細胞進行鑒定（圖2），明確重組質粒在酵母菌中高表達。而后超聲破壁處理酵母菌（對蛋白質活性沒有不利影響），分離純化獲得SynBioNFs，使用納米流式（NanoFCM）對其粒徑分布進行檢測（圖2 e, f），約為70 nm。

圖2. 流式對酵母菌蛋白表達圖譜(a,b,d,e)、NanoFCM對SynBioNFs的粒徑表征(c,f)

三、SynBioNFs捕獲納米探針
為了更好的為生物標志物提供捕獲反應界面和提高探針的檢測靈敏度，作者選用納米金作為SynBioNFs探針的載體平臺，將SynBioNFs固定在金微電極表面。作為捕獲探針，SynBioNFs（修飾W25-MatterTag作為表面結合劑）僅需10 min就能與金表面完全結合，這與W25-MatterTag輔助的可溶性蛋白固定在材料表面一致。
 

圖3. SynBioNFs（W25-MatterTag）在金表面的固定化

四、SynBioNFs檢測納米探針
SynBioNFs（修飾Sb68-SpyTag作為表面結合劑）可與SpyCatcher包被的金銀合金納米盒通過簡單的孵育完成自動組裝，偶聯(lián)產(chǎn)生用于讀取高度特異性和靈敏信號的檢測納米探針。為了驗證SpyTag和SpyCatcher在探針結構中的關鍵作用，作者制備了不同的偶聯(lián)物組合，與RBD-mNeonGreen反應后，通過NanoFCM檢測熒光信號強度以評估SynBioNFs作為生物探針的優(yōu)越性。結果顯示，Bioconjugate 1（同時含有SpyTag和SpyCatcher的生物偶聯(lián)物）的熒光強度遠高于其他組，這一結果表明了SpyTag和SpyCatcher這個偶聯(lián)結構在SynBioNFs和納米盒連接過程中的必要性，使用SpyTag和SpyCatcher作為一種簡單和模塊化的生物偶聯(lián)方法，為納米探針生物功能化提供了一個潛在的有效策略。
 

圖4. SpyTag和SpyCatcher在SynBioNFs與金-銀合金納米盒結合探針中的作用

此外，為了驗證SynBioNFs與納米金-銀盒的組裝速率，作者利用NanoFCM檢測不同孵育時長制備的SynBioNFs（Sb68-SpyTag）金銀合金納米盒（包被SpyCatcher）生物偶聯(lián)物，發(fā)現(xiàn)孵育1 min即可實現(xiàn)85.8%組裝效率，孵育時間在10 min和30 min的組裝效率對比無顯著差異，即該偶聯(lián)系統(tǒng)可在10 min內快速完成組裝。
 

圖5. NanoFCM對SynBioNFs與納米金-銀盒的不同時長組裝效果檢測

綜上，SynBioNFs在捕獲能力、熒光強度、組裝速度等方面均展現(xiàn)了顯著性的優(yōu)勢。緊接著作者使用SynBioNFs在SERS、熒光分析、比色法LFA等不同技術平臺驗證了其對SCV2病毒檢測的特異性和濃度敏感性，結果確認了SynBioNFs與RBD對SCV2反應的高特異性和低濃度響應需求。SynBioNFs作為下一代納米探針，與市場上的傳統(tǒng)探針相比，具有低成本高效益且制造簡單的優(yōu)勢，在疾病診斷方面擁有非常廣闊的應用前景。

NanoFCM展望
NanoFCM覆蓋傳統(tǒng)流式200 nm以下的檢測盲區(qū)，在生物納米探針的設計和研發(fā)過程監(jiān)測中具有顯著的優(yōu)勢：單次檢測即可獲得納米探針的粒徑、濃度等物理參數(shù)，同時還可基于NanoFCM的超高熒光靈敏度，快速檢測功能組分結合之后的熒光強度水平，進一步優(yōu)化組分設計，提升探針的檢出靈敏度。當然，NanoFCM還可基于熒光抗體或染料標記策略驗證探針的組裝效率、甚至是構建好的探針與待測病毒樣品的結合效率等，助力納米探針研發(fā)全流程，推進納米探針在疾病診斷中的應用。