前列腺癌患者在接受雄激素受體信號(hào)抑制劑（ARSI）治療后，可能會(huì)出現(xiàn)耐藥性，導(dǎo)致治療誘導(dǎo)的神經(jīng)內(nèi)分泌樣前列腺癌（therapy-induced neuroendocrine-like prostate cancer,t-NEPC）發(fā)生。t-NEPC是一種高侵襲性亞型，具有小細(xì)胞樣特征，對(duì)紫杉醇化療具有耐藥性，且總體生存率較差。t-NEPC的適應(yīng)性神經(jīng)特征是否是導(dǎo)致這種紫杉醇耐藥性的原因尚不清楚。
 
2024年8月25日，美國(guó)內(nèi)布拉斯加大學(xué)M. Jordan Rowley & Samikshan Dutta團(tuán)隊(duì)合作試圖揭示t-NEPC的神經(jīng)適應(yīng)性特征是否與紫杉醇耐藥性有關(guān)。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)分析患者基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)，并通過(guò)ATAC-Seq、乙�；�組蛋白ChIP-seq和RNA-seq等測(cè)序分析，探討了Pax5作為轉(zhuǎn)錄因子在t-NEPC中的作用，以及其在神經(jīng)內(nèi)分泌樣特征基因表達(dá)中的重要性。相關(guān)研究成果以“Understanding the function of Pax5 in development of docetaxel-resistant neuroendocrine-like prostate cancers”為題發(fā)表在Nature出版集團(tuán)旗下刊物《Cell Death & Disease》上。
 

標(biāo)題：Understanding the function of Pax5 in development of docetaxel-resistant neuroendocrine-like prostate cancers（Pax5在多西紫杉醇耐藥性神經(jīng)內(nèi)分泌樣前列腺癌發(fā)展中的作用）
發(fā)表期刊：Cell Death & Disease
影響因子：8.1 / 1區(qū)
技術(shù)平臺(tái)：ATAC-seq、ChIP-seq、RNA-seq等
 
本研究旨在理解Pax5在多西紫杉醇（多西他賽，docetaxel）耐藥性神經(jīng)內(nèi)分泌樣前列腺癌（t-NEPC）發(fā)展中的作用。首先，研究通過(guò)對(duì)患者基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)的通路分析表明，t-NEPC上調(diào)與增強(qiáng)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的多種神經(jīng)通路。為鑒定可能對(duì)促進(jìn)t-NEPC中神經(jīng)特征基因表達(dá)重要的轉(zhuǎn)錄因子（TF），研究在NE樣細(xì)胞系模型中進(jìn)行了ATAC-Seq、乙�；�組蛋白ChIP-seq和RNA-seq測(cè)序，并分析了轉(zhuǎn)錄活躍且顯著富集的神經(jīng)內(nèi)分泌樣（NE樣）癌特異性基因的啟動(dòng)子。分析結(jié)果表明，Pax5可能是一個(gè)對(duì)神經(jīng)基因表達(dá)重要的轉(zhuǎn)錄因子，且在t-NEPC中具有特異性。通路分析揭示Pax5表達(dá)參與軸突導(dǎo)向、神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)控和神經(jīng)粘附，這些對(duì)強(qiáng)大的細(xì)胞通訊至關(guān)重要。進(jìn)一步結(jié)果表明，Pax5耗竭破壞了NE樣細(xì)胞中神經(jīng)突介導(dǎo)的細(xì)胞通訊，并減少表面生長(zhǎng)因子受體激活，從而提高對(duì)多西紫杉醇治療的敏感性。t-NEPC特異性Pax5啟動(dòng)子CpG島的羥甲基化有利于Pbx1結(jié)合，從而誘導(dǎo)Pax5表達(dá)。基于此研究可以得出結(jié)論，持續(xù)暴露于ARSI療法會(huì)導(dǎo)致t-NEPC中Pax5激活的表觀遺傳修飾，促進(jìn)采用耐紫杉醇NE樣癌癥所需的基因表達(dá)。因此，靶向Pax5軸可能有助于恢復(fù)其紫杉醇敏感性。
 
研究方法：

• 利用公開(kāi)的患者RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
• 在NE樣細(xì)胞系模型中進(jìn)行ATAC-Seq、乙�；�組蛋白ChIP-seq和RNA-seq。
• 通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析、基因集富集分析（GSEA）和基因本體（GO）分析等生物信息學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)解析。
• 通過(guò)實(shí)驗(yàn)操作，如siRNA干擾、過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等，研究Pax5在細(xì)胞中的功能。

 
結(jié)果圖形
（1）NE樣轉(zhuǎn)化適應(yīng)特異性基因特征

圖1：神經(jīng)內(nèi)分泌分化攜帶神經(jīng)元特征。

A. C4-2BER細(xì)胞與C4-2B細(xì)胞之間的RNA表達(dá)差異。
B. 對(duì)腺癌（C4-2B和C4-2，每組三個(gè)重復(fù)）和神經(jīng)內(nèi)分泌樣（NE樣）細(xì)胞（C4-2BER和DKD，每組三個(gè)重復(fù)）之間的基因表達(dá)進(jìn)行比較研究。I型基因集代表由REST抑制因子調(diào)控的基因，II型表示參與神經(jīng)內(nèi)分泌途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。所有這些細(xì)胞系的RNA表達(dá)分析在RNA-seq之后進(jìn)行。
C. 在類(lèi)似的腺癌和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞系中對(duì)雄激素受體（AR）調(diào)控的基因進(jìn)行比較分析。
D. 維恩圖表示兩種不同的神經(jīng)內(nèi)分泌樣細(xì)胞系中共同差異表達(dá)的基因。
E. 使用共有差異富集的基因集，使用gProfiler進(jìn)行通路分析。BP代表生物學(xué)通路，MF代表分子通路。散點(diǎn)圖表示與神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)化相關(guān)的差異化富集通路。
 
（2）染色質(zhì)可及性和組蛋白乙�；�增加，在NE樣轉(zhuǎn)化過(guò)程中誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活
 

圖2：神經(jīng)內(nèi)分泌分化中的染色質(zhì)可及性差異。

A. 熱圖顯示C4-2B和C4-2BER中差異上調(diào)基因的ATAC-Seq信號(hào)比較。
B. 熱圖顯示C4-2B和C4-2BER中差異下調(diào)基因的ATAC-Seq信號(hào)比較。
C. IGV瀏覽器顯示C4-2B和C4-2BER中Hox A基因位點(diǎn)的差異ATAC seq信號(hào)。
D. 免疫印跡顯示C4-2B和C4-2BER中H3K9、H3K18和H3K27組蛋白乙�；�水平。
E. 熱圖顯示C4-2B和C4-2BER中差異活躍位點(diǎn)H3K27ac和H3K18ac的ChIP-Seq信號(hào)比較。
F. 維恩圖顯示C4-2BER ATAC-seq峰值上發(fā)生的差異化ChIP-Seq（H3K18ac和H3K27ac）峰值重疊。
G. 圖2F的差異活躍染色質(zhì)位點(diǎn)附近的基因的RNA-seq表達(dá)水平（TPM）。
 
（3）神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)分化后Pax5表達(dá)增加

圖3：新可接近啟動(dòng)子附近的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合差異。

 A. 熱圖顯示A. C4-2B和C4-2BER細(xì)胞（N=3）中的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)。
 B.  C4-2和DKD細(xì)胞（N=3）。
C-D.  RT-PCR顯示C4-2與DKD以及C4-2B與C4-2BER細(xì)胞中Pax5、ETV5、FOXC1、ETS2、KLF12、ELF3的相對(duì)基因表達(dá)。
E. 圖像顯示與由TOMTOM確定的Pax5 motif相比，在差異活躍位點(diǎn)識(shí)別的motif。

圖4：Pax5在不同細(xì)胞類(lèi)型中的表達(dá)。

A. 免疫印跡圖顯示C4-2、C4-2B、C4-2BER、DKD和NCI-H660中Pax5的比較表達(dá)，HSC70為對(duì)照。（n=3）。
B. RT-PCR顯示C4-2B和C4-2BAR細(xì)胞中Pax5的RNA表達(dá)。
C. 從小鼠細(xì)胞系中耗竭RB1后Pax5表達(dá)。
D. 在LuCaP TMA中對(duì)Pax5進(jìn)行染色。代表性的IHC染色顯示了Pax5在腺癌、CRPC和NE樣癌癥中的表達(dá)。
E. 在轉(zhuǎn)移性前列腺TMA中對(duì)Pax5進(jìn)行染色。圖中顯示IHC檢測(cè)的Pax5表達(dá)。
 
（4）Pax5 參與神經(jīng)元通路相關(guān)基因表達(dá)譜
 

圖5：Pax5在NE樣細(xì)胞中調(diào)控多種與神經(jīng)相關(guān)通路。

A. 在Pax5耗竭后，C4-2BER和DKD中Pax5調(diào)控的重要神經(jīng)通路基因表達(dá)熱圖。
B. 使用在Pax5耗竭后NE樣細(xì)胞中差異調(diào)控的Pax5基因進(jìn)行GSEA通路分析。
C-D. 在NE樣細(xì)胞C4-2BER和DKD中，通過(guò)siRNA短暫耗竭Pax5后，驗(yàn)證Pax5調(diào)控的基因集。
E-F.  在NE樣細(xì)胞（DKD）中，通過(guò)多西環(huán)素誘導(dǎo)的兩個(gè)獨(dú)立shRNA短暫耗竭Pax5后，驗(yàn)證Pax5調(diào)控的基因集。
G.  ChIP-qPCR顯示與陰性對(duì)照PGM5（兩組引物P1和P2）和IgG相比，Pax5調(diào)控基因富集情況。
 
（5）Pax5耗竭增強(qiáng)了多西他賽在t-NEPC中的治療效果。
 

圖6：Pax5耗竭影響細(xì)胞通訊并增強(qiáng)治療效果。

A-E. 免疫熒光圖像顯示在Pax5耗竭后，DKD和C4-2BER細(xì)胞表面NCAM1表達(dá)情況，耗竭方法包括siRNA或shRNA（多西環(huán)素誘導(dǎo)，shRNA表達(dá)以紅色熒光顯示）或在Pax5敲低細(xì)胞中異位表達(dá)Pax5。
F.  超級(jí)圖表代表在Pax5耗竭和Pax5過(guò)表達(dá)下，C4-2BER和DKD中類(lèi)神經(jīng)突數(shù)量的定量分析。
G. 在DKD中，在對(duì)照和Pax5耗竭條件下，免疫印跡顯示生物素拉下樣本中NCAM1表達(dá)。也顯示了對(duì)照和Pax5耗竭下的總蛋白。
H-K.  在有或沒(méi)有Pax5情況下，通過(guò)丙碘銨染色在DKD和C4-2BER細(xì)胞中分別定量化療應(yīng)激下的細(xì)胞活力。
L-M.  免疫熒光圖像顯示在DKD和C4-2BER細(xì)胞中有或沒(méi)有Pax5情況下，磷脂酰肌醇激酶（p-AKT S-473）表面染色（DKD為品紅色，C4-2BER為綠色）；條形圖顯示定量。
N. 在DKD中，在對(duì)照和Pax5敲低條件下，免疫印跡顯示p-AKT 473和總AKT的表達(dá)。
O. 在DKD中，在對(duì)照和Pax5敲低條件下，免疫印跡顯示p-EGFR與總EGFR的表達(dá)。
 
（6）Pbx1調(diào)控NE樣前列腺癌中Pax5表達(dá)
 

圖7：Pbx1調(diào)控Pax5。

A. C4-2B和C4-2BER細(xì)胞中Pax5啟動(dòng)子附近的ATAC-seq和H3K18/H3K27乙�；疌hIP-seq信號(hào)。
B. DKD與C4-2以及C4-2BER與C4-2B中Pbx1的表達(dá)。
C. 腺癌和NE樣細(xì)胞中Pbx1表達(dá)的免疫印跡。
D-E.  在DKD和C4-2BER細(xì)胞中Pbx1耗竭后Pax5表達(dá)的RT-PCR分析。
F.   C4-2BER細(xì)胞中Pbx1耗竭后Pax5表達(dá)的免疫印跡。
G.  使用設(shè)計(jì)在Pax5啟動(dòng)子上游的引物進(jìn)行Pbx1 ChIP-qPCR。
H.  DKD和C4-2細(xì)胞中Pax5基因的Epic甲基化芯片分析示意圖。綠色三角形代表位于CpG島的區(qū)域。放大了兩細(xì)胞系近端啟動(dòng)子的胞嘧啶甲基化狀態(tài)，并顯示了每個(gè)區(qū)域的甲基化狀態(tài)。紅色代表甲基化/修飾的胞嘧啶，綠色是去甲基化胞嘧啶。Pbx1在啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)由箭頭表示。
I.  各種前列腺癌細(xì)胞系中TET2表達(dá)的免疫印跡。
J.  Pbx1結(jié)合位點(diǎn)的Pax5啟動(dòng)子區(qū)域通過(guò)ChIP-qPCR分析了5hmC足跡標(biāo)記。
K.  DKD細(xì)胞用Bobcat339（50μM，18-24小時(shí)）處理后進(jìn)行5hmC和Pbx1 ChIP-qPCR，并與未處理的對(duì)照樣本比較。
L.  對(duì)DKD細(xì)胞用5-Azacytidine（0.1μM，5-7天）和Bobcat339處理后，進(jìn)行RT-PCR分析Pax5基因表達(dá)。
M. 在t-NEPC維持中Pbx1/Pax5調(diào)控的整體示意圖。

參考文獻(xiàn)：
Bhattacharya S, Harris HL, Islam R, Bodas S, Polavaram N, Mishra J, Das D, Seshacharyulu P, Kalluchi A, Pal A, Kohli M, Lele SM, Muders M, Batra SK, Ghosh PM, Datta K, Rowley MJ, Dutta S. Understanding the function of Pax5 in development of docetaxel-resistant neuroendocrine-like prostate cancers. Cell Death Dis. 2024 Aug 25;15(8):617. pii: 10.1038/s41419-024-06916-y. doi: 10.1038/s41419-024-06916-y. PubMed PMID: 39183332.