本文要點(diǎn)：短波紅外 （SWIR） 成像可在臨床和臨床前應(yīng)用中增強(qiáng)生物組織穿透深度并減少自發(fā)熒光。然而，現(xiàn)有應(yīng)用通常無(wú)法在沒(méi)有造影劑的情況下探測(cè)化學(xué)成分和分子特異性的能力。作者提出了一種 SWIR 成像方法，該方法可以在大視場(chǎng)中可視化組織深處的自發(fā)拉曼散射，并表現(xiàn)出明顯的化學(xué)對(duì)比度。本文的結(jié)果表明，拉曼散射有效地解決了自發(fā)熒光在短至 892 nm 的照明波長(zhǎng)下造成內(nèi)源性組織背景較高的問(wèn)題。通過(guò)體內(nèi)監(jiān)測(cè)全身組織成分動(dòng)力學(xué)和無(wú)創(chuàng)檢測(cè)小鼠脂肪肝疾病，以及鑒定未固定的人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的鈣化和脂質(zhì)，展示了 SWIR 拉曼成像的多功能性。此外，該方法有助于可視化嵌入到脂肪組織中的神經(jīng)，這是外科應(yīng)用的重大進(jìn)步。SWIR 拉曼成像采用與熒光正交的簡(jiǎn)單寬場(chǎng)設(shè)置，有望被臨床醫(yī)生和生物學(xué)家迅速采用。這項(xiàng)技術(shù)為全動(dòng)物病理生理學(xué)的無(wú)造影劑可視化和人類術(shù)中成像開(kāi)辟了新的可能性。

 

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本文利用 SWIR 成像來(lái)實(shí)現(xiàn)大視野組織深處的自發(fā)拉曼散射可視化。通過(guò)使用 892 至 1064 nm 之間的照明波長(zhǎng)，克服了以前生物組織自發(fā)拉曼成像中的自發(fā)熒光限制，并提供了優(yōu)異的化學(xué)對(duì)比度。為了證明 SWIR 拉曼成像的強(qiáng)大功能，作者展示了其無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)小鼠模型和人體組織中動(dòng)態(tài)生理和病理組織重塑的能力。

圖1. 寬視場(chǎng)宏觀 SWIR 拉曼成像系統(tǒng)設(shè)計(jì)、體外驗(yàn)證和初步生物學(xué)演示

 

為了在 SWIR 光譜區(qū)域?qū)�宏觀自發(fā)拉曼散射進(jìn)行成像，作者設(shè)計(jì)了一個(gè)簡(jiǎn)單的成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)由類似于檢測(cè) SWIR 熒光的組件組成。拉曼成像是通過(guò)用特定波長(zhǎng)漫射照射樣品并用窄帶通濾光片過(guò)濾散射光來(lái)實(shí)現(xiàn)的（圖 1 a ）。這些濾光片選擇性地捕獲與感興趣的拉曼位移相對(duì)應(yīng)的散射波長(zhǎng)，這些波長(zhǎng)被確定為照明波長(zhǎng)和對(duì)應(yīng)于特定鍵能量位移的波長(zhǎng)的組合。

 

基于新啟用的在大視場(chǎng)中可視化拉曼散射的能力，作者研究了完整小鼠體內(nèi)生物組織的全身化學(xué)對(duì)比。脂肪組織脂肪庫(kù)和位于胸骨下方的劍突軟骨在 CH 區(qū)的完整皮膚中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的對(duì)比度，而 OH 波段的信號(hào)分布在整個(gè)身體中（圖 1 d ）。此外，皮下淋巴結(jié)和脂肪組織脂肪庫(kù)根據(jù)它們的相對(duì)水分和脂質(zhì)含量清晰可辨，由它們各自的 OH 和 CH 拉曼強(qiáng)度決定。這種化學(xué)對(duì)比與背景自發(fā)熒光明顯不同。

 

此外，SWIR 拉曼成像能夠通過(guò)人體皮膚實(shí)現(xiàn)化學(xué)對(duì)比的可視化。通過(guò) CH 拉曼信號(hào)觀察了手和手指背表面的皮下脂肪墊， OH 拉曼帶則突出了伸肌腱和相鄰的手背骨間肌（圖 1 e-f ）。值得注意的是，在皮下血管下觀察到脂肪墊和肌腱的拉曼對(duì)比，這產(chǎn)生了負(fù)對(duì)比，尤其是在 CH 區(qū)域。相比之下，自發(fā)熒光主要表現(xiàn)在皮膚表面的皺紋中。

 

這些初步發(fā)現(xiàn)突出了 SWIR 拉曼成像的能力，即在大于 50 cm 的視場(chǎng)內(nèi)，根據(jù)皮膚的化學(xué)對(duì)比無(wú)創(chuàng)識(shí)別生物組織，無(wú)需使用造影劑。

圖2. 在照明波長(zhǎng)等于或高于 892 nm 的寬場(chǎng)成像中，拉曼散射是組織背景的主要來(lái)源

 

為了了解不同照明波長(zhǎng)對(duì)組織化學(xué)對(duì)比度的影響并確定其優(yōu)點(diǎn)和局限性，作者從完整小鼠身上獲取了 SWIR 拉曼圖像，照明波長(zhǎng)從 785 nm（拉曼成像中常用的波長(zhǎng)）到 1064 nm（紅移波長(zhǎng)，將拉曼散射波長(zhǎng)延伸到標(biāo)準(zhǔn) InGaAs 探測(cè)器的極限之外）。研究結(jié)果表明，一旦照明波長(zhǎng)達(dá)到 892 nm，化學(xué)對(duì)比度（特別是脂肪組織脂肪庫(kù)中 CH 區(qū)域的化學(xué)對(duì)比度）就會(huì)變得比自發(fā)熒光更強(qiáng)，并繼續(xù)上升到 1064 nm（圖 2 a-d）。即使使用長(zhǎng)通濾光片在同一幀內(nèi)捕獲拉曼靜默區(qū)域，這種基于拉曼的對(duì)比度增加也是顯而易見(jiàn)的，突出表明，即使在非特定的寬成像帶內(nèi)，較長(zhǎng)照明下化學(xué)對(duì)比度的增強(qiáng)也能有效克服自發(fā)熒光。然而，較長(zhǎng)的波長(zhǎng)需要較慢的成像幀速率，需要根據(jù)特定的應(yīng)用要求平衡對(duì)比度和采集速度。

圖3. 小鼠病理生理學(xué)中化學(xué)造影劑的無(wú)創(chuàng)體內(nèi) SWIR 拉曼成像

 

隨后，作者探索了 SWIR 拉曼成像在臨床前小鼠模型中全身水平身體成分非侵入性可視化的應(yīng)用。最初，為了檢測(cè)脂肪組織表型，對(duì)遺傳性肥胖小鼠 （ob/ob） 進(jìn)行了成像，由于缺乏飽腹感激素瘦素，與年齡匹配的對(duì)照相比，體重增加多達(dá)三倍。拉曼 CH 區(qū)域?qū)Ρ韧怀隽怂麄內(nèi)�身脂肪組織脂肪庫(kù)的豐度（圖 3 a）。

 

接下來(lái)，作者評(píng)估了 SWIR 拉曼成像在肝脂肪變性無(wú)創(chuàng)化學(xué)造影劑檢測(cè)中的潛力，對(duì)小鼠進(jìn)行宏觀 SWIR 拉曼成像。通過(guò)完整的皮膚，檢測(cè)到喂食 MCD 飲食的小鼠肝臟中的拉曼 CH 強(qiáng)度高于喂食正常飲食的同窩小鼠（圖 3 b-d）。這些發(fā)現(xiàn)證明了 SWIR 拉曼成像作為 MASLD 等疾病進(jìn)展過(guò)程中組織成分變化的全身、無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)的寶貴工具的潛力。

 

轉(zhuǎn)向體內(nèi)應(yīng)用后，作者利用 SWIR 拉曼成像縱向監(jiān)測(cè)活體小鼠的組織動(dòng)力學(xué)，展示了其無(wú)創(chuàng)和無(wú)標(biāo)記的特性。系統(tǒng)跟蹤禁食的小鼠體內(nèi)身體成分變化的能力，觀察到禁食 24 小時(shí)后脂肪組織中散射的拉曼 CH 區(qū)強(qiáng)烈減少，這在再進(jìn)食后 48 小時(shí)內(nèi)逆轉(zhuǎn)（圖 3 e ）。

圖4. SWIR 拉曼成像用于對(duì)小鼠和人類未固定樣品中的組織成分進(jìn)行離體分析

 

本文研究了 SWIR 拉曼光譜儀在測(cè)量未固定組織中脂質(zhì)含量的應(yīng)用，這將能夠進(jìn)行直接組織分析，同時(shí)保持其天然和完整的成分。事實(shí)上，作者在會(huì)誘導(dǎo)肥胖和肝脂肪變性的高脂肪飲食（圖4）的野生型小鼠的肝臟中觀察到更強(qiáng)的 CH 強(qiáng)度，表明脂質(zhì)含量較高。

 

采用 SWIR 拉曼成像來(lái)可視化未固定的人類斑塊中的異質(zhì)組織成分。利用在外翻血栓動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)期間從患者獲得的頸動(dòng)脈或股動(dòng)脈切除的動(dòng)脈粥樣硬化組織，靶向 PO4-3960 cm-1 處的拉曼峰檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊鈣化，CH 區(qū)檢測(cè)脂質(zhì)。值得注意的是，觀察到斑塊內(nèi)顯示鈣化或大量脂質(zhì)含量的不同結(jié)構(gòu)域，無(wú)需進(jìn)行組織處理，例如固定、脫鈣、切片和染色（圖 4 d-e）。通過(guò)比較采用固定和脫鈣方案前后的成像結(jié)果來(lái)驗(yàn)證拉曼造影劑對(duì)鈣化的特異性。該方案消除了 PO4-3信號(hào)并降低 CH 強(qiáng)度（圖 4 f-g ）。

圖5. 使用 SWIR 拉曼成像對(duì)豬手術(shù)模型脂肪組織的神經(jīng)進(jìn)行鑒定

 

雖然神經(jīng)可以在視覺(jué)上與肌肉組織區(qū)分開(kāi)來(lái)，但當(dāng)它們嵌入脂肪組織中時(shí)，它們?cè)诳梢?jiàn)光下的識(shí)別變得非常困難（圖 5 a）。本文采用 SWIR 拉曼成像來(lái)可視化豬模型中的面神經(jīng)。、結(jié)果顯示，基于拉曼成像，脂肪組織內(nèi)存在強(qiáng)烈的神經(jīng)對(duì)比（圖 5 b-c ）。最重要的是，SWIR 拉曼成像能夠揭示在可見(jiàn)光下不可見(jiàn)的隱藏結(jié)構(gòu)。盡管血管中存在可以肉眼識(shí)別的 OH 信號(hào)，但研究結(jié)果表明 SWIR 拉曼成像在術(shù)中環(huán)境中的潛力。通過(guò)利用無(wú)標(biāo)記化學(xué)造影劑，它無(wú)需外源性造影劑即可實(shí)現(xiàn)神經(jīng)等關(guān)鍵結(jié)構(gòu)的可視化。

 

在這項(xiàng)工作中，作者推出了一種新穎的基于拉曼散射的成像方法，該方法能夠在單幀中實(shí)現(xiàn)高化學(xué)對(duì)比度，而無(wú)需自發(fā)熒光減法或光譜解混，視野超過(guò) 50 cm2，實(shí)現(xiàn)新的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用.研究結(jié)果表明，當(dāng)組織用 892 或更長(zhǎng)的波長(zhǎng)照射時(shí)，基于拉曼散射的化學(xué)對(duì)比克服了自發(fā)熒光。這表明寬場(chǎng)拉曼成像應(yīng)利用這些波長(zhǎng)來(lái)獲得最佳化學(xué)對(duì)比度，因此需要 SWIR 拉曼散射檢測(cè)。除了自發(fā)熒光抑制之外，SWIR 拉曼成像還利用了該波長(zhǎng)范圍固有的光學(xué)優(yōu)勢(shì)，例如更深的組織穿透、更強(qiáng)的成像對(duì)比度和更高的分辨率。本研究的結(jié)果在 892 nm 照明下每幀 10 秒曝光內(nèi)顯示出明顯的化學(xué)對(duì)比和高信噪比。采用目前正在開(kāi)發(fā)的更大、更靈敏的 SWIR 探測(cè)器，將實(shí)現(xiàn)更高的信噪比和更短的曝光時(shí)間。

 

總之，SWIR 拉曼成像不僅將拉曼成像的應(yīng)用擴(kuò)展到宏觀尺度，而且擴(kuò)展了生物醫(yī)學(xué)成像的整體能力。通過(guò)與傳統(tǒng)熒光成像保持正交，這種簡(jiǎn)單的方法支持多模式策略，從而為臨床前和臨床應(yīng)用開(kāi)辟了新的途徑。在手術(shù)環(huán)境中，它的使用有望通過(guò)實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)（例如隱藏在脂肪組織中的神經(jīng)）的可視化而帶來(lái)立竿見(jiàn)影的好處，從而解決當(dāng)今接受手術(shù)的患者面臨的主要風(fēng)險(xiǎn)。

 

參考文獻(xiàn)

Arus B A, Yiu J, Lingg J G P, et al. Macroscopic label-free biomedical imaging with shortwave infrared Raman scattering[J]. bioRxiv, 2024: 2024.06. 10.597863.

 

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