本文要點：本文研究了在熒光引導(dǎo)手術(shù)中含有西妥昔單抗-IRDye800CW的臨床樣本的SWIR 相較于 NIR 成像的潛在益處。通過記錄吸收和發(fā)射光譜來檢查表皮生長因子靶向 NIR 染料西妥昔單抗-IRDye800CW 在短波范圍內(nèi)的效果。使用含有西妥昔單抗-IRDye800CW 的鱗狀細(xì)胞癌 （PSCC） 和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌 （HNSCC） 患者臨床腫瘤樣本對 NIR 和 SWIR 圖像進(jìn)行離體比較。比較基于腫瘤背景比和適應(yīng)性對比噪聲比 （aCNR），使用護(hù)理病理學(xué)組織評估標(biāo)準(zhǔn)作為金標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)發(fā)射光譜，可以在 SWIR 范圍內(nèi)檢測到西妥昔單抗-IRDye800CW。在臨床 PSCC 樣本中，發(fā)現(xiàn)總體SWIR成像性能與NIR成像相似（在檢查的 2/7 標(biāo)準(zhǔn)中，NIR 成像優(yōu)于 SWIR，在 3/7 標(biāo)準(zhǔn)中，SWIR 優(yōu)于 NIR）。然而，在檢查HNSCC 數(shù)據(jù)時，NIR 在幾乎所有 （5/7） 檢查標(biāo)準(zhǔn)中都優(yōu)于 SWIR。這種差異似乎源于 HNSCC 組織中的背景自發(fā)熒光壓倒了off-peak SWIR 熒光信號。在離體臨床樣本中使用靶向示蹤劑西妥昔單抗-IRDye800CW 的 SWIR 成像目前沒有提供比 NIR 成像額外的好處。SWIR 區(qū)域的背景熒光導(dǎo)致更高的背景信號，限制了 HNSCC 樣品中的 SWIR 成像。然而，SWIR 顯示出增加 PSCC 樣本中腫瘤邊界對比度的潛力。

 

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本文報告了與 NIR 成像相比，腫瘤組織 SWIR 成像在外科腫瘤學(xué)中的潛在臨床益處的研究。為此，使用臨床樣本的熒光圖像將SWIR 成像與 NIR 光譜范圍內(nèi)的成像進(jìn)行了比較。為了進(jìn)行這種比較，評估了 ICG 和 IRDye800CW 在SWIR 光譜范圍內(nèi)的光學(xué)特性，并選擇了目前可用的最佳 NIR 成像系統(tǒng)。從而能夠在鱗狀細(xì)胞癌 （PSCC） 和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌 （HNSCC） 的臨床樣本中使用表皮生長因子受體 （EGFR） 靶向 NIR 染料西妥昔單抗-IRDye800CW 在腫瘤可視化中對 SWIR 和 NIR 光譜成像進(jìn)行系統(tǒng)比較。所有測量均在體外進(jìn)行。目前，這是首次使用包含臨床相關(guān)和最佳劑量的這種靶向染料的臨床樣本來比較 SWIR 和 NIR 成像結(jié)果。改進(jìn)熒光分子成像（FMI）方法可以改善腫瘤切緣評估，使患者預(yù)后受益。

圖1. 近紅外和 SWIR 圖像配準(zhǔn)。選擇幾個相關(guān)點使用平移矩陣（T）疊加圖像。

 

近紅外（NIR）和短波紅外（SWIR）的對比是基于離體整體組織樣本和組織切片的圖像進(jìn)行的。首先，離體整體組織樣本的熒光圖像進(jìn)行了比較，因為這些圖像更能代表兩個系統(tǒng)在臨床使用中的預(yù)期效果。圖像的對比是以腫瘤組織的白光圖像作為參考，比較了NIR和SWIR圖像中高熒光強度和低熒光強度區(qū)域的位置。

隨后，利用先前獲取的組織切片作為基準(zhǔn)，更精確地比較NIR和SWIR成像。這些組織切片的腫瘤和背景分割可以通過病理學(xué)家在H&E染色切片上的標(biāo)記進(jìn)行確認(rèn)，并與相應(yīng)組織切片的熒光圖像相關(guān)聯(lián)。為了進(jìn)行有用的對比，需要分析NIR和SWIR熒光圖像中相同區(qū)域的組織切片。因此，在MATLAB中使用“cpselect”和“fitgeotrans”函數(shù)進(jìn)行了半自動圖像配準(zhǔn)，使用相似性變換類型獲取變換矩陣（T）。

盡管對組織切除標(biāo)本進(jìn)行了實時熒光引導(dǎo)手術(shù)，但兩種成像方式之間的有意義比較需要通過H&E 病理學(xué)評估。因此，對含有腫瘤的組織切片進(jìn)行了比較，病理學(xué)家在其上指示了腫瘤邊界。此外，使用具有光滑表面的組織切片可以采集兩個系統(tǒng)可比較的熒光圖像，從而促進(jìn)更好的圖像配準(zhǔn)（圖1）。最后，使用組織切片可能會減少 SWIR 成像在更深組織穿透方面的積極影響，從而減少散射。當(dāng)樣品厚度大于 NIR 成像的穿透深度時，SWIR 最能顯示出其優(yōu)勢，因為在這種情況下，SWIR 成像的深度更深。在這項研究中，使用了4至5毫米厚的組織切片，估計 NIR 成像的組織穿透率∼2.2毫米。因此，在切片中，SWIR 在穿透深度方面仍有望顯示出優(yōu)于 NIR 的優(yōu)勢。

圖2. 含有西妥昔單抗-IRDye800CW的小管的半峰全寬 （FWHM） 測量，該管嵌入脂肪乳 （a） 和牛組織 （b） 中，深度為 0、1、3 和 5 mm。強度分布基于使用各種濾光片獲得的熒光圖像中歸一化強度的平均值。

 

對于SWIR成像系統(tǒng)，最佳設(shè)置是基于不同深度下包埋在乳脂和牛組織中的IRDye800CW管熒光圖像的全寬半高（FWHM）選擇的。如圖2所示，使用1300nm的長波通濾光片（LP 1300-nm）在乳脂和牛組織測量中都能得到最低的FWHM。然而，在檢查歸一化強度圖時，噪聲變得更加明顯，這可能是由于最大熒光強度較低導(dǎo)致的。使用1200nm的長波通濾光片（LP 1200-nm）僅顯示FWHM平均增加了7%，同時減少了抑制對比度的噪聲。因此，使用1200nm的長波通濾光片被認(rèn)為是最佳的。根據(jù)圖2的結(jié)果，SWIR成像在3mm的深度下應(yīng)該是可靠的。

圖3. 代表性頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC，上排）和前列腺鱗狀細(xì)胞癌（PSCC，下排）切除標(biāo)本的白光和NIR及SWIR熒光圖像。NIR和SWIR系統(tǒng)的熒光圖像顯示了相似的熒光模式。

 

一共有八名患者參與，其中六名為前列腺鱗狀細(xì)胞癌（PSCC）患者，兩名為頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）患者。圖3中的熒光圖像顯示腫瘤和背景中熒光信號的分布相似。這些和其他拍攝的圖像表明NIR和SWIR圖像具有相似的對比度。然而，由于缺乏病理分析中腫瘤確切位置的知識，客觀評估存在困難。因此，分析了組織切片。

圖4. 代表前列腺鱗狀細(xì)胞癌（PSCC）和五片頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）的示例。

 

切除的標(biāo)本包括共計十七片前列腺鱗狀細(xì)胞癌（PSCC）和五片頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）腫瘤組織切片，這些切片根據(jù)病理學(xué)家的評估進(jìn)行了分割。每個組織切片上繪制了四條線，分別得出PSCC的68條線和HNSCC的20條線。為比較NIR和SWIR成像在組織切片和線條上的表現(xiàn)，評估了多項標(biāo)準(zhǔn)。圖4中給出了這些參數(shù)的概覽。

為了比較NIR和SWIR成像性能，評估超出腫瘤邊界的信號衰減似乎是一個有用的方面。因此，對穿過腫瘤進(jìn)入背景組織的線條進(jìn)行了NIR和SWIR信號的比較，見圖4。首先，文本考慮在腫瘤中觀察到的最低熒光強度是否能提供一個閾值，用于表征腫瘤中像素的最低熒光強度。背景中熒光強度超過該閾值的像素數(shù)量將表明該標(biāo)準(zhǔn)的穩(wěn)健性，并可以在NIR和SWIR數(shù)據(jù)之間進(jìn)行比較。這種比較導(dǎo)致了NIR和SWIR歸一化熒光強度的像素散點圖。對比度的計算是通過腫瘤組織中像素強度與背景像素強度之間的重疊進(jìn)行的，結(jié)果顯示SWIR在PSCC中重疊顯著較少，而在HNSCC中重疊顯著較多。像素強度圖的簡單線性回歸顯示，PSCC的中位數(shù)r²為0.550（0.233至0.740），HNSCC為0.260（0.0625至0.385）。Bland-Altman分析顯示PSCC和HNSCC的偏差分別為0.0384（σ=0.175）和0.0957（σ=0.257）。

最后，考慮了三個不同的指標(biāo)。首先，在一條線上繪制像素的歸一化強度[圖4 (b/f)]顯示，PSCC中NIR和SWIR的圖表相當(dāng)，而HNSCC的對比顯示出不同的強度分布。隨后，使用病理分割計算并繪制了對應(yīng)線條上的TBR和aCNR[分別見圖4(c/g)和4(d/h)]。一條線上的平均TBR顯示，PSCC中NIR和SWIR沒有顯著差異，但在HNSCC中發(fā)現(xiàn)了傾向于NIR的顯著差異。比較線上aCNR時，SWIR在PSCC中顯著優(yōu)于NIR，而在HNSCC中，NIR顯著優(yōu)于SWIR。在比較aCNR曲線的AUC時也得到了相同的結(jié)果。在更詳細(xì)地檢查HNSCC樣本時（圖5），發(fā)現(xiàn)NIR信號與腫瘤組織對應(yīng)，而SWIR信號不對應(yīng)。在評估PSCC和HNSCC SWIR圖像中的腫瘤和背景中的平均計數(shù)時，SWIR HNSCC圖像中的背景自體熒光變得明顯。對于腫瘤組織，這些是可比的，但HNSCC樣本背景中的計數(shù)更高。即使在沒有任何示蹤劑的HNSCC患者組織中，也觀察到了SWIR光譜范圍內(nèi)的背景自體熒光，而在NIR光譜范圍內(nèi)沒有。

圖5. HNSSC，PSCC 鱗狀細(xì)胞癌的NIR和SWIR熒光圖像與蘇木精-伊紅（H&E）染色的對比示例。

 

有趣的是，在基于aCNR比較NIR和SWIR圖像時，研究者觀察到在病理分析指定的腫瘤邊界處，aCNR曲線似乎在aCNR=1處交叉，而絕對強度和TBR與腫瘤邊界沒有關(guān)系[分別見圖8(d/h)與圖8(b/f)和圖8(c/g)]。因此，計算了基于病理分析的aCNR=1交叉點到腫瘤邊界的絕對距離。對于PSCC，找到交叉點的正一致性為91.8%，負(fù)一致性為36.8%。對于HNSCC，正一致性為75.0%。由于NIR在所有情況下都找到了交叉點，因此無法確定負(fù)一致性。在PSCC和HNSCC中，aCNR=1交叉點與實際腫瘤邊界的交叉點之間的中位距離在NIR中顯著更低。

然而，在外科腫瘤學(xué)中，腫瘤邊緣對比度和腫瘤邊界像素強度的差異可能更為重要。使用垂直于腫瘤邊界的線[圖4 (a/e)]，比較了兩個系統(tǒng)的對比度和像素強度。在PSCC中，沿線的aCNR和腫瘤中的aCNR的AUC在SWIR成像中顯著更高，而TBR沒有差異。這再次表明背景中的較高熒光變化σ對NIR圖像的影響。然而，NIR顯示了到腫瘤邊界的較小絕對距離。盡管差異顯著，但觀察到的中位距離差異僅為0.2毫米，這可能是由手動分割誤差和/或半自動圖像配準(zhǔn)與相應(yīng)分辨率的結(jié)合造成的。這種偏差的臨床相關(guān)性是可疑的，因為手術(shù)刀的厚度為0.1至0.5毫米。對于HNSCC，NIR成像在各個方面的性能都顯著優(yōu)于SWIR成像。這是由于SWIR熒光模式與病理結(jié)果之間的差異，而NIR顯示的熒光模式與病理結(jié)果一致（圖5）。

研究者注意到，根據(jù)H&E染色，aCNR曲線在垂直于腫瘤邊界的線上的表現(xiàn)是比較腫瘤邊界的高度相關(guān)參數(shù)。使用定義的aCNR，當(dāng)aCNR=1的線與病理評估的腫瘤邊界相交時，其偏差在PSCC的NIR和SWIR成像系統(tǒng)中均在成像系統(tǒng)分辨率的三倍以內(nèi)（見圖4）。HNSCC圖像中的發(fā)現(xiàn)顯示，NIR系統(tǒng)具有相似的結(jié)果，而SWIR成像系統(tǒng)的偏差較大。

在首次使用含有靶向染料的臨床組織樣本進(jìn)行比較時，本文發(fā)現(xiàn)使用靶向示蹤劑西妥昔單抗-IRDye800CW的非峰值SWIR熒光成像目前相比NIR成像沒有提供額外的好處。這可能的一個重要原因是，在臨床研究中使用的示蹤劑劑量比臨床前研究中使用的劑量低一百倍。未來的劑量研究應(yīng)對此進(jìn)行調(diào)查。需要考慮的另一個方面是，在某些組織類型中，背景熒光會淹沒SWIR光譜范圍內(nèi)的NIR示蹤劑的非峰值熒光，這限制了這種SWIR成像方法。當(dāng)新的專用SWIR染料獲得臨床使用批準(zhǔn)時，情況可能會有所改變。此外，本文開發(fā)了一種方法來系統(tǒng)地比較熒光圖像，使用改良的對比噪聲比（CNR），識別熒光邊界，并且這種方法似乎適用于不同波長的熒光系統(tǒng)，與病理分析一致。

 

參考文獻(xiàn)

Keizers B, Nijboer T S, van der Fels C A M, et al. Systematic comparison of fluorescence imaging in the near-infrared and shortwave-infrared spectral range using clinical tumor samples containing cetuximab-IRDye800CW[J]. Journal of Biomedical Optics, 2025, 30(S1): S13708-S13708.

 

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