RNA-BS揭示動(dòng)物不同發(fā)育階段的mRNA m5C甲基化圖譜和調(diào)控機(jī)制
m5C是已知的RNA修飾之一，但其在mRNA中的發(fā)育動(dòng)態(tài)、功能和進(jìn)化仍然知之甚少。最初報(bào)道m(xù)5C在mRNA中普遍存在，但后來認(rèn)識(shí)到許多最初被鑒定的位點(diǎn)可能假陽性。準(zhǔn)確和系統(tǒng)地檢測(cè)轉(zhuǎn)錄組范圍mRNA m5C水平一直具有挑戰(zhàn)性，缺乏對(duì)m5C修飾豐度和分布一致性觀點(diǎn)。為了克服這一挑戰(zhàn)，2019年研究人員基于富集mRNA的RNA亞硫酸鹽測(cè)序（BS-seq）可以穩(wěn)健的鑒定和定量分析mRNA m5C位點(diǎn)。RNA-BS通常在成年哺乳動(dòng)物組織中只鑒定出幾百個(gè)mRNA m5C位點(diǎn)，這些有限的位點(diǎn)分類為兩種類型：Type I m5C位點(diǎn)和Type II m5C位點(diǎn)。Type I m5C位點(diǎn)包含下游富含G的三聯(lián)體motif，位于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的5'端，由NSUN2甲基化；Type II m5C位點(diǎn)，包含下游UCCA motif，位于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)中，由NSUN6甲基化。
為理解mRNA m5C的分布、功能和進(jìn)化，中山大學(xué)張銳、徐艷文、周燦權(quán)團(tuán)隊(duì)和浙江大學(xué)戈萬忠團(tuán)隊(duì)利用RNA-BS測(cè)序技術(shù)對(duì)6個(gè)動(dòng)物物種樣本進(jìn)行分析，以構(gòu)建不同發(fā)育階段的mRNA m5C的定量圖譜。分析結(jié)果表明mRNA m5C主要存在于母源mRNA。進(jìn)一步使用細(xì)胞模型和動(dòng)物模型來研究母源mRNA廣泛甲基化背后的機(jī)制以及m5C在早期胚胎發(fā)育中的生物學(xué)重要性。最后利用比較表觀轉(zhuǎn)錄組方法揭示兩個(gè)主要的m5C調(diào)控創(chuàng)新步驟和單m5C位點(diǎn)的快速進(jìn)化。相關(guān)研究成果以“Developmental mRNA m5C landscape and regulatory innovations of massive m5C modification of maternal mRNAs in animals”為題在Nature子刊《自然通訊》（Nature Communications）上發(fā)表。
標(biāo)題：Developmental mRNA m5C landscape and regulatory innovations of massive m5C modification of maternal mRNAs in animals
中文題目：動(dòng)物中發(fā)育mRNA m5C圖譜和母源mRNA大規(guī)模m5C修飾的調(diào)控創(chuàng)新
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：IF 14.7 / 1區(qū)
本研究通過RNA-BS生成了果蠅、斑馬魚、非洲爪蟾、熱帶爪蟾、小鼠、人類這六個(gè)物種（包括脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物）共計(jì)82個(gè)樣本在不同發(fā)育階段的定量mRNA m5C圖譜。分析結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)母源mRNA的巨大甲基化由NSUN2和NSUN6介導(dǎo)，且這種現(xiàn)象趨同且意外。以果蠅作為模型，揭示了缺乏母源mRNA m5C的胚胎經(jīng)歷了細(xì)胞周期延遲，并未能及時(shí)啟動(dòng)母源-合子轉(zhuǎn)換（maternal-to-zygotic transition），表明了母源mRNA m5C的功能重要性。從無脊椎動(dòng)物到人類的譜系，觀察到兩波m5C調(diào)控創(chuàng)新：更高等動(dòng)物在mRNA的5'端獲得由NSUN2介導(dǎo)的順式m5C位點(diǎn)，同時(shí)伴隨著更具結(jié)構(gòu)化的5'UTR區(qū)域的出現(xiàn)；人類獲得個(gè)由NSUN6介導(dǎo)的橫向m5C位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在調(diào)控有絲分裂細(xì)胞周期的基因中富集。本研究表明了早期胚胎發(fā)育機(jī)制的存在及其調(diào)控創(chuàng)新，并為闡明mRNA m5C在生物學(xué)和疾病中的作用提供了關(guān)鍵資源。
研究方法：
樣本收集：從6個(gè)不同物種（包括人類、小鼠、斑馬魚、果蠅等）收集了多個(gè)發(fā)育階段的樣本。
RNA亞硫酸鹽測(cè)序（RNA-BS-seq）：用于富集mRNA并定量m5C位點(diǎn)。
基因編輯：使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在果蠅中生成NSUN2基因突變體。
RNA-seq：分析野生型和NSUN2敲除果蠅胚胎的轉(zhuǎn)錄組。
結(jié)果圖形：
（1）在脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物物種中，母源mRNA高甲基化
圖1：在脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中，母源mRNAs通過NSUN2和NSUN6高甲基化。
a. 系統(tǒng)發(fā)育樹（左）和本研究中采樣的物種發(fā)育階段（右）。
b. 本研究分析的樣本中m5C位點(diǎn)的數(shù)量和甲基化水平，帶有m5C位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄基因的百分比，以及m5C位點(diǎn)的密度。密度定義為每千個(gè)C（至少被20次reads）的m5C位點(diǎn)數(shù)量。選擇了在成年組織中具有最高m5C水平的小鼠肌肉樣本29來代表合子mRNA m5C模式。
c. 每個(gè)物種中母源m5C位點(diǎn)的基因位置。標(biāo)明了m5C位點(diǎn)的數(shù)量和Type I和Type II位點(diǎn)的百分比。
d. 不同物種中母源m5C位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄本分布。
（2）在非人類物種中，母源mRNA的m5C修飾主要由NSUN2沉積
圖2：卵母細(xì)胞中mRNA m5C的沉積以及NSUN2在早期胚胎發(fā)生中的體內(nèi)功能。
a. 在不同階段的果蠅卵巢表達(dá)GFP-NSUN2融合蛋白的代表性圖像，該融合蛋白在其天然啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)。
b. 用抗NSUN2抗體染色的人類GV/MI/MII卵母細(xì)胞的代表性圖像。11個(gè)GV，14個(gè)MI，和14個(gè)MII卵母細(xì)胞被染色，所有檢查的卵母細(xì)胞中NSUN2的定位一致。
c-d. 經(jīng)nocodazole處理0, 24, 48, 和72小時(shí)的HeLa細(xì)胞中Type I m5C位點(diǎn)的密度（c）和水平（d）。
e. 經(jīng)nocodazole處理72小時(shí)的HeLa細(xì)胞和MII卵母細(xì)胞之間Type I mRNA m5C位點(diǎn)的重疊。
f. 野生型果蠅和NSUN2敲除果蠅卵巢中m5C甲基化水平的比較。顯示Type I和Type II m5C位點(diǎn)。
g. 0-2小時(shí)胚胎在不同胚胎發(fā)育階段的百分比定量。
h. 前兩個(gè)主成分分析（PCA），共同解釋了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中82.6%的變異。
（3）在高等動(dòng)物中，順式調(diào)控創(chuàng)新介導(dǎo)5'端Type I位點(diǎn)增加
b. 在單獨(dú)表達(dá)人類、小鼠和斑馬魚NSUN2的NSUN2敲除HeLa細(xì)胞中Type I m5C位點(diǎn)的分布。
c. 母源m5C密度與轉(zhuǎn)錄組GC含量之間的關(guān)系。
d. 不同物種的GC含量的宏基因組分析。通過對(duì)更具代表性的脊椎動(dòng)物物種分析，發(fā)現(xiàn)在鳥類和哺乳動(dòng)物的共同祖先中獲得了5'端高GC含量。
（4）跨式調(diào)控創(chuàng)新導(dǎo)致數(shù)千個(gè)人特異性Type II位點(diǎn)增加
圖4：順式調(diào)控創(chuàng)新導(dǎo)致數(shù)千個(gè)人特異性Type II位點(diǎn)增加。
a. 比較了代表不同物種母源mRNA甲基化狀態(tài)的選定樣本以及代表人類合子mRNA甲基化狀態(tài)的hESC H1中Type I和Type II位點(diǎn)的水平。
b. 人類MII卵母細(xì)胞、hESC H1和人類TE中Type II m5C位點(diǎn)的分布。
c. 人類MII卵母細(xì)胞、hESC H1、人類TE和小鼠MII卵母細(xì)胞中Type II m5C位點(diǎn)及其相鄰區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)metaprofiles。
d. 人MII卵母細(xì)胞、hESC H1、人TE和小鼠MII卵母細(xì)胞中Type II位點(diǎn)核心motif位點(diǎn)+3堿基組成。
e. 人類MII卵母細(xì)胞中僅由NSUN6調(diào)控的基因的富集圖。
（5）m5C位點(diǎn)的快速進(jìn)化。
圖5：mRNA m5C的序列和結(jié)構(gòu)依賴性進(jìn)化。
a. 脊椎動(dòng)物物種間保守m5C位點(diǎn)的數(shù)量和百分比的成對(duì)比較。線條的長(zhǎng)度與物種間的分化時(shí)間成比例。分別展示了所有m5C位點(diǎn)（黑色）、Type I m5C位點(diǎn)（藍(lán)色）和Type II m5C位點(diǎn)（紅色）的數(shù)量和百分比。使用的樣本：人類和小鼠，MII期卵母細(xì)胞；青蛙，0期；斑馬魚，0小時(shí)受精后（hpf）；果蠅，0-0.5小時(shí)胚胎。保守的甲基化位點(diǎn)，指在一個(gè)物種中水平≥10%，在另一個(gè)物種中水平>5%的m5C位點(diǎn)。只考慮在兩個(gè)物種中至少被十次reads覆蓋的保守C。
b. 人類和小鼠之間保守和非保守Type I和Type II m5C位點(diǎn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的metaprofiles。保守的，指在兩個(gè)物種中都甲基化的m5C位點(diǎn)。人類特異的或小鼠特異的，指在兩個(gè)物種的DNA水平上都是C，但只在人類或小鼠中甲基化的m5C位點(diǎn)。使用的樣本：人類和小鼠MII期卵母細(xì)胞。
c. 人類和小鼠之間Type I位點(diǎn)獲得或丟失的序列和結(jié)構(gòu)因素的GLM系數(shù)。
d. 人類和小鼠之間保守和非保守Type II位點(diǎn)的基序和相鄰區(qū)域的堿基替換率。
e. 人類和小鼠之間Type II位點(diǎn)獲得或喪失的結(jié)構(gòu)特征的GLM系數(shù)。
f. Type I motif中G的數(shù)量與五個(gè)Type I底物的m5C水平之間的關(guān)系。
g. 5個(gè)Type I底物的莖突變與它們的m5C水平之間的關(guān)系。
參考文獻(xiàn)：
Liu J, Huang T, Chen W, Ding C, Zhao T, Zhao X, Cai B, Zhang Y, Li S, Zhang L, Xue M, He X, Ge W, Zhou C, Xu Y, Zhang R. Developmental mRNA m5C landscape and regulatory innovations of massive m5C modification of maternal mRNAs in animals. Nat Commun. 2022 May 5;13(1):2484. pii: 10.1038/s41467-022-30210-0. doi: 10.1038/s41467-022-30210-0. PubMed PMID: 35513466.
為理解mRNA m5C的分布、功能和進(jìn)化，中山大學(xué)張銳、徐艷文、周燦權(quán)團(tuán)隊(duì)和浙江大學(xué)戈萬忠團(tuán)隊(duì)利用RNA-BS測(cè)序技術(shù)對(duì)6個(gè)動(dòng)物物種樣本進(jìn)行分析，以構(gòu)建不同發(fā)育階段的mRNA m5C的定量圖譜。分析結(jié)果表明mRNA m5C主要存在于母源mRNA。進(jìn)一步使用細(xì)胞模型和動(dòng)物模型來研究母源mRNA廣泛甲基化背后的機(jī)制以及m5C在早期胚胎發(fā)育中的生物學(xué)重要性。最后利用比較表觀轉(zhuǎn)錄組方法揭示兩個(gè)主要的m5C調(diào)控創(chuàng)新步驟和單m5C位點(diǎn)的快速進(jìn)化。相關(guān)研究成果以“Developmental mRNA m5C landscape and regulatory innovations of massive m5C modification of maternal mRNAs in animals”為題在Nature子刊《自然通訊》（Nature Communications）上發(fā)表。
標(biāo)題：Developmental mRNA m5C landscape and regulatory innovations of massive m5C modification of maternal mRNAs in animals
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：IF 14.7 / 1區(qū)
本研究通過RNA-BS生成了果蠅、斑馬魚、非洲爪蟾、熱帶爪蟾、小鼠、人類這六個(gè)物種（包括脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物）共計(jì)82個(gè)樣本在不同發(fā)育階段的定量mRNA m5C圖譜。分析結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)母源mRNA的巨大甲基化由NSUN2和NSUN6介導(dǎo)，且這種現(xiàn)象趨同且意外。以果蠅作為模型，揭示了缺乏母源mRNA m5C的胚胎經(jīng)歷了細(xì)胞周期延遲，并未能及時(shí)啟動(dòng)母源-合子轉(zhuǎn)換（maternal-to-zygotic transition），表明了母源mRNA m5C的功能重要性。從無脊椎動(dòng)物到人類的譜系，觀察到兩波m5C調(diào)控創(chuàng)新：更高等動(dòng)物在mRNA的5'端獲得由NSUN2介導(dǎo)的順式m5C位點(diǎn)，同時(shí)伴隨著更具結(jié)構(gòu)化的5'UTR區(qū)域的出現(xiàn)；人類獲得個(gè)由NSUN6介導(dǎo)的橫向m5C位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在調(diào)控有絲分裂細(xì)胞周期的基因中富集。本研究表明了早期胚胎發(fā)育機(jī)制的存在及其調(diào)控創(chuàng)新，并為闡明mRNA m5C在生物學(xué)和疾病中的作用提供了關(guān)鍵資源。
研究方法：
樣本收集：從6個(gè)不同物種（包括人類、小鼠、斑馬魚、果蠅等）收集了多個(gè)發(fā)育階段的樣本。
RNA亞硫酸鹽測(cè)序（RNA-BS-seq）：用于富集mRNA并定量m5C位點(diǎn)。
基因編輯：使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在果蠅中生成NSUN2基因突變體。
RNA-seq：分析野生型和NSUN2敲除果蠅胚胎的轉(zhuǎn)錄組。
結(jié)果圖形：
（1）在脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物物種中，母源mRNA高甲基化
圖1：在脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中，母源mRNAs通過NSUN2和NSUN6高甲基化。
b. 本研究分析的樣本中m5C位點(diǎn)的數(shù)量和甲基化水平，帶有m5C位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄基因的百分比，以及m5C位點(diǎn)的密度。密度定義為每千個(gè)C（至少被20次reads）的m5C位點(diǎn)數(shù)量。選擇了在成年組織中具有最高m5C水平的小鼠肌肉樣本29來代表合子mRNA m5C模式。
c. 每個(gè)物種中母源m5C位點(diǎn)的基因位置。標(biāo)明了m5C位點(diǎn)的數(shù)量和Type I和Type II位點(diǎn)的百分比。
d. 不同物種中母源m5C位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄本分布。
（2）在非人類物種中，母源mRNA的m5C修飾主要由NSUN2沉積
圖2：卵母細(xì)胞中mRNA m5C的沉積以及NSUN2在早期胚胎發(fā)生中的體內(nèi)功能。
b. 用抗NSUN2抗體染色的人類GV/MI/MII卵母細(xì)胞的代表性圖像。11個(gè)GV，14個(gè)MI，和14個(gè)MII卵母細(xì)胞被染色，所有檢查的卵母細(xì)胞中NSUN2的定位一致。
c-d. 經(jīng)nocodazole處理0, 24, 48, 和72小時(shí)的HeLa細(xì)胞中Type I m5C位點(diǎn)的密度（c）和水平（d）。
e. 經(jīng)nocodazole處理72小時(shí)的HeLa細(xì)胞和MII卵母細(xì)胞之間Type I mRNA m5C位點(diǎn)的重疊。
f. 野生型果蠅和NSUN2敲除果蠅卵巢中m5C甲基化水平的比較。顯示Type I和Type II m5C位點(diǎn)。
g. 0-2小時(shí)胚胎在不同胚胎發(fā)育階段的百分比定量。
h. 前兩個(gè)主成分分析（PCA），共同解釋了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中82.6%的變異。
（3）在高等動(dòng)物中，順式調(diào)控創(chuàng)新介導(dǎo)5'端Type I位點(diǎn)增加
圖3：順式調(diào)控創(chuàng)新導(dǎo)致高等動(dòng)物中5'端Type I位點(diǎn)增加。
a. 維恩圖顯示了在野生型HeLa細(xì)胞和單獨(dú)表達(dá)人類、小鼠和斑馬魚NSUN2的NSUN2敲除HeLa細(xì)胞中鑒定的Type I位點(diǎn)的重疊。b. 在單獨(dú)表達(dá)人類、小鼠和斑馬魚NSUN2的NSUN2敲除HeLa細(xì)胞中Type I m5C位點(diǎn)的分布。
c. 母源m5C密度與轉(zhuǎn)錄組GC含量之間的關(guān)系。
d. 不同物種的GC含量的宏基因組分析。通過對(duì)更具代表性的脊椎動(dòng)物物種分析，發(fā)現(xiàn)在鳥類和哺乳動(dòng)物的共同祖先中獲得了5'端高GC含量。
（4）跨式調(diào)控創(chuàng)新導(dǎo)致數(shù)千個(gè)人特異性Type II位點(diǎn)增加
圖4：順式調(diào)控創(chuàng)新導(dǎo)致數(shù)千個(gè)人特異性Type II位點(diǎn)增加。
b. 人類MII卵母細(xì)胞、hESC H1和人類TE中Type II m5C位點(diǎn)的分布。
c. 人類MII卵母細(xì)胞、hESC H1、人類TE和小鼠MII卵母細(xì)胞中Type II m5C位點(diǎn)及其相鄰區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)metaprofiles。
d. 人MII卵母細(xì)胞、hESC H1、人TE和小鼠MII卵母細(xì)胞中Type II位點(diǎn)核心motif位點(diǎn)+3堿基組成。
e. 人類MII卵母細(xì)胞中僅由NSUN6調(diào)控的基因的富集圖。
（5）m5C位點(diǎn)的快速進(jìn)化。
圖5：mRNA m5C的序列和結(jié)構(gòu)依賴性進(jìn)化。
b. 人類和小鼠之間保守和非保守Type I和Type II m5C位點(diǎn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的metaprofiles。保守的，指在兩個(gè)物種中都甲基化的m5C位點(diǎn)。人類特異的或小鼠特異的，指在兩個(gè)物種的DNA水平上都是C，但只在人類或小鼠中甲基化的m5C位點(diǎn)。使用的樣本：人類和小鼠MII期卵母細(xì)胞。
c. 人類和小鼠之間Type I位點(diǎn)獲得或丟失的序列和結(jié)構(gòu)因素的GLM系數(shù)。
d. 人類和小鼠之間保守和非保守Type II位點(diǎn)的基序和相鄰區(qū)域的堿基替換率。
e. 人類和小鼠之間Type II位點(diǎn)獲得或喪失的結(jié)構(gòu)特征的GLM系數(shù)。
f. Type I motif中G的數(shù)量與五個(gè)Type I底物的m5C水平之間的關(guān)系。
g. 5個(gè)Type I底物的莖突變與它們的m5C水平之間的關(guān)系。
參考文獻(xiàn)：
Liu J, Huang T, Chen W, Ding C, Zhao T, Zhao X, Cai B, Zhang Y, Li S, Zhang L, Xue M, He X, Ge W, Zhou C, Xu Y, Zhang R. Developmental mRNA m5C landscape and regulatory innovations of massive m5C modification of maternal mRNAs in animals. Nat Commun. 2022 May 5;13(1):2484. pii: 10.1038/s41467-022-30210-0. doi: 10.1038/s41467-022-30210-0. PubMed PMID: 35513466.
標(biāo)簽：
RNA甲基化
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