DAP-seq助力揭示番茄抗酸鋁分子調(diào)控新機(jī)制
2024年10月2日，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院營(yíng)養(yǎng)逆境與品質(zhì)改良楊建立/范偉團(tuán)隊(duì)在Horticulture Research期刊(IF=7.6)上在線發(fā)表題為“SlSTOP1-regulated SlHAK5 expression confers Al tolerance in tomato by facilitating citrate secretion from roots”的研究論文。該研究通過DAP-seq和RNA-seq在全基因組水平挖掘了番茄抗酸鋁核心轉(zhuǎn)錄因子SlSTOP1互作位點(diǎn)，明確了受SlSTOP1直接調(diào)控的抗酸鋁基因，并對(duì)其中一個(gè)與鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SlHAK5在抗酸鋁中的功能進(jìn)行了解析。
云南省酸性土壤占了土地面積50%左右，在pH低于5.5的酸性耕地中，44%為旱地，33%為水田。土壤酸化導(dǎo)致的酸鋁脅迫，礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素缺乏，以及土傳病害高發(fā)，嚴(yán)重制約著云南省農(nóng)作物的優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)。Cys2His2型鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子STOP1在高等植物中既保守又功能多變，而番茄中SlSTOP1調(diào)控抗酸鋁的分子生理機(jī)制仍未得到系統(tǒng)研究。
為了鑒定SlSTOP1蛋白的全基因組結(jié)合靶點(diǎn)，作者進(jìn)行了DNA親和純化測(cè)序（DAP-seq）實(shí)驗(yàn)。兩個(gè)重復(fù)中共有peak數(shù)量為7824個(gè)，分布在不同染色體上。這些結(jié)合位點(diǎn)主要集中在基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）周圍2 Kb的區(qū)域內(nèi)，其中有68%的結(jié)合位點(diǎn)位于基因間區(qū)。同時(shí)鑒定到SlSTOP1結(jié)合的motif：5′-CCTTCCCCAGATAA-3′。
為了鑒定SlSTOP1蛋白的全基因組結(jié)合靶點(diǎn)，作者進(jìn)行了DNA親和純化測(cè)序（DAP-seq）實(shí)驗(yàn)。兩個(gè)重復(fù)中共有peak數(shù)量為7824個(gè)，分布在不同染色體上。這些結(jié)合位點(diǎn)主要集中在基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）周圍2 Kb的區(qū)域內(nèi)，其中有68%的結(jié)合位點(diǎn)位于基因間區(qū)。同時(shí)鑒定到SlSTOP1結(jié)合的motif：5′-CCTTCCCCAGATAA-3′。
圖1 通過DAP-seq技術(shù)鑒定SlSTOP1在全基因組的結(jié)合位點(diǎn)
為了確定SlSTOP1在鋁脅迫下的直接靶點(diǎn)，作者對(duì)多組樣本進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，將RNA-seq中的327個(gè)overlap DEGs與DAP-seq中的啟動(dòng)子靶向基因進(jìn)行聯(lián)合分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在鋁脅迫下SlSTOP1通過與39個(gè)基因的啟動(dòng)子結(jié)合進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。這些SlSTOP1直接調(diào)控的Al應(yīng)答基因在功能上可分為轉(zhuǎn)運(yùn)體、轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)傳導(dǎo)、代謝等基因。39個(gè)基因中有7個(gè)與已知的耐鋁基因同源，表明這些目標(biāo)基因可能是番茄中最重要的耐鋁基因。作者將基因SlRAE1、SlSTAR1、SlHAK5和SlAAE3-1進(jìn)行可視化，發(fā)現(xiàn)SlSTOP1與這些基因的結(jié)合位點(diǎn)位于tss附近。隨后作者挑選了SlHAK5基因進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和EMSA驗(yàn)證。
圖2 SlSTOP1與Al調(diào)控基因簇的結(jié)合及其直接調(diào)控
本研究成功挖掘到酸鋁脅迫下受SlSTOP1直接調(diào)控的39個(gè)下游靶基因，包括課題組先前發(fā)現(xiàn)的甲酸鹽脫氫酶基因SlFDH（The Plant Journal,2023,113:387–401；doi: 10.1111/tpj.16054）和本研究中揭示的鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SlHAK5。上述研究的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步闡明了番茄抗酸鋁核心分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為創(chuàng)制耐酸鋁番茄新種質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。
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