DAP-seq助力揭示SmHSFA8調(diào)控茄子耐熱性機(jī)制
2024年12月17日，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院曹必好教授團(tuán)隊(duì)在Plant, Cell & Environment（中科院一區(qū)Top期刊，影響因子7.6）在線發(fā)表了題為SmHSFA8 enhances the heat tolerance of eggplant by regulating the SmEGY3-SmCSD1 module and promoting SmF3H-mediated flavonoid biosynthesis的研究論文。該文章借助DAP-seq技術(shù)探究了SmHSFA8通過調(diào)控SmEGY3-SmCSD1模塊和SmF3H介導(dǎo)的類黃酮生物合成提高茄子耐熱性的分子機(jī)制。
研究背景
茄子的幼苗、花器官和果實(shí)均會受到高溫脅迫的影響。高溫脅迫嚴(yán)重影響了茄子的生長發(fā)育、生產(chǎn)以及商品價(jià)值。然而，關(guān)于茄子耐熱調(diào)控的分子機(jī)理尚不清晰。該團(tuán)隊(duì)前期篩選和鑒定了耐熱型和熱敏型茄子材料，分析了它們在高溫脅迫下生理生化的差異；對高溫脅迫下耐熱型和熱敏型茄子材料進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序分析，篩選和鑒定出候選高溫響應(yīng)基因SmEGY3；并探究了SmEGY3-SmCSD1模塊在茄子調(diào)控耐熱中的分子機(jī)制。
研究結(jié)果
以SmEGY3作為誘餌蛋白，通過酵母雙雜交（Y2H）實(shí)驗(yàn)篩選到了熱激轉(zhuǎn)錄因子 SmHSFA8，并通過熒光素酶互補(bǔ)成像（LCI）和雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）等實(shí)驗(yàn)證實(shí) SmHSFA8 與 SmEGY3 相互作用。此外，酵母單雜交（Y1H）、凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）和雙熒光素酶報(bào)告（DLR）實(shí)驗(yàn)表明 SmHSFA8 可結(jié)合 SmEGY3 啟動(dòng)子并激活其表達(dá)，且兩者相互作用增強(qiáng)了 SmEGY3 對 SmCSD1 的激活功能。這些結(jié)果表明 SmHSFA8 可能參與調(diào)控茄子的耐熱性。
通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明SmHSFA8正調(diào)控茄子的耐熱性。
茄子的幼苗、花器官和果實(shí)均會受到高溫脅迫的影響。高溫脅迫嚴(yán)重影響了茄子的生長發(fā)育、生產(chǎn)以及商品價(jià)值。然而，關(guān)于茄子耐熱調(diào)控的分子機(jī)理尚不清晰。該團(tuán)隊(duì)前期篩選和鑒定了耐熱型和熱敏型茄子材料，分析了它們在高溫脅迫下生理生化的差異；對高溫脅迫下耐熱型和熱敏型茄子材料進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序分析，篩選和鑒定出候選高溫響應(yīng)基因SmEGY3；并探究了SmEGY3-SmCSD1模塊在茄子調(diào)控耐熱中的分子機(jī)制。
研究結(jié)果
以SmEGY3作為誘餌蛋白，通過酵母雙雜交（Y2H）實(shí)驗(yàn)篩選到了熱激轉(zhuǎn)錄因子 SmHSFA8，并通過熒光素酶互補(bǔ)成像（LCI）和雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）等實(shí)驗(yàn)證實(shí) SmHSFA8 與 SmEGY3 相互作用。此外，酵母單雜交（Y1H）、凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）和雙熒光素酶報(bào)告（DLR）實(shí)驗(yàn)表明 SmHSFA8 可結(jié)合 SmEGY3 啟動(dòng)子并激活其表達(dá)，且兩者相互作用增強(qiáng)了 SmEGY3 對 SmCSD1 的激活功能。這些結(jié)果表明 SmHSFA8 可能參與調(diào)控茄子的耐熱性。
通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明SmHSFA8正調(diào)控茄子的耐熱性。
圖1 SmHSFA8與SmEGY3的互作及活性分析
圖2 SmHSFA8正調(diào)控植物的耐熱性
為了闡明 SmHSFA8 調(diào)控茄子耐熱性的分子機(jī)制，作者進(jìn)行了DAP - Seq實(shí)驗(yàn)。基于兩次重復(fù)，共鑒定出2272個(gè)SmHSFA8 結(jié)合峰，其中12.59% 位于靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，有286個(gè)基因。使用 Meme-ChIP鑒定出六個(gè)具有高可信度的motif，這些motif可能是 SmHSFA8 的結(jié)合位點(diǎn)，其中基序3和6的序列與HSFs 結(jié)合位點(diǎn)的典型基序HSEs高度相似，并找到了SmHSPs基因：SmHSP70、SmHSP70B和SmHSP21。KEGG分析顯示SmHSFA8 的靶基因參與多個(gè)代謝過程，如類黃酮生物合成，SmF3H同樣參與類黃酮生物合成過程。經(jīng)過HTT（高溫處理）后，SmHSP70B、SmHSP21和SmF3H在耐熱茄子品系中的表達(dá)量高于熱敏茄子品系。
圖3 使用DAP – Seq技術(shù)鑒定SmHSFA8在全基因組的結(jié)合位點(diǎn)
凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）、酵母單雜交（Y1H）、雙熒光素酶報(bào)告（DLR）等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SmHSP21、SmHSP70、SmHSP70B和SmF3H是SmHSFA8的下游靶基因。SmHSFA8能調(diào)控茄子中SmHSPs和SmF3H基因的表達(dá)以及類黃酮的生物合成。通過VIGS沉默SmF3H降低了茄子的類黃酮含量和耐熱性，此外，外源類黃酮處理減輕了HTS對茄子的損害。
圖4 SmHSFA8結(jié)合SmHSP70、SmHSP70B、SmHSP21啟動(dòng)子并激活其表達(dá)
圖5 SmHSFA8調(diào)控植物F3H表達(dá)和類黃酮含量
研究結(jié)果與結(jié)論
SmHSFA8是茄子耐熱性的重要調(diào)節(jié)因子。在高溫脅迫下，SmHSFA8基因上調(diào)表達(dá)；隨后，SmHSFA8激活SmHSPs基因的表達(dá)，介導(dǎo)SmEGY3-SmCSD1模塊和促進(jìn)SmF3H介導(dǎo)的類黃酮生物合成，進(jìn)而調(diào)控茄子的耐熱性。本研究為開展茄子抗逆分子育種和選育茄子耐熱材料提供有用的基因資源和理論依據(jù)。
SmHSFA8是茄子耐熱性的重要調(diào)節(jié)因子。在高溫脅迫下，SmHSFA8基因上調(diào)表達(dá)；隨后，SmHSFA8激活SmHSPs基因的表達(dá)，介導(dǎo)SmEGY3-SmCSD1模塊和促進(jìn)SmF3H介導(dǎo)的類黃酮生物合成，進(jìn)而調(diào)控茄子的耐熱性。本研究為開展茄子抗逆分子育種和選育茄子耐熱材料提供有用的基因資源和理論依據(jù)。
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