林奇綜合征（Lynch Syndrome，LS）是一種常染色體顯性遺傳疾病，會(huì)導(dǎo)致直腸癌或其他部位罹患惡性腫瘤，約3%結(jié)直腸癌由LS引起，是最常見的遺傳性結(jié)直腸癌綜合征。

林奇綜合癥是因?yàn)殄e(cuò)配修復(fù)基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM等）的胚系突變所誘發(fā)的。已有研究表明7號(hào)染色體上錯(cuò)配修復(fù)基因PMS2（band p22.1，如圖1）的破壞性突變與兩種遺傳性癌癥綜合征有關(guān)：體質(zhì)性錯(cuò)配修復(fù)缺陷（CMMRD）和林奇綜合征（LS）。7號(hào)染色體上存在有15個(gè)PMS2假基因和覆蓋PMS2基因3'部分（外顯子9-15區(qū)域）的100kb低拷貝數(shù)重復(fù)序列（LCR，又稱節(jié)段重復(fù)）。同時(shí)，反向LCR序列的第二個(gè)拷貝位于離著絲粒700kb的位置，與端粒拷貝（包含PMS2CL假基因）具有95%以上的同源性。雖然LCR間的倒位現(xiàn)象會(huì)導(dǎo)致PMS2基因活化突變，但因LCR之間相隔很遠(yuǎn)且序列同源性高，已有NGS測(cè)序方法無法對(duì)這種復(fù)雜的情況實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，亟需新的技術(shù)或方法對(duì)相關(guān)基因的大結(jié)構(gòu)變異進(jìn)行精準(zhǔn)研究。

圖1.hg38參考基因組中PMS2基因位置圖

 

利用來自the Ashkenazi trio（HG002、HG003、HG004）的Coriell細(xì)胞系樣本，研究人員在體外用Cas9核酸內(nèi)切酶靶向選擇切割200kb的基因組DNA片段，并通過HLS-CATCH技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行超長DNA片段回收。回收得到的200kb DNA片段，既橫跨整個(gè)端粒LCR加上LCR兩側(cè)約50kb的獨(dú)特側(cè)翼序列，又包含整個(gè)未重排的PMS2基因，因此能夠完成PMS2基因座的短讀長測(cè)序，同時(shí)不會(huì)引起著絲粒LCR或PMS2假基因的并發(fā)問題。為了測(cè)試涉及LCR區(qū)域的倒位現(xiàn)象，使用不同的Cas9切割端粒LCR外的相同端粒近端位點(diǎn)，以及在著絲粒LCR內(nèi)部約50kb的獨(dú)特序列中的第二切割位點(diǎn)。第二次Cas9切割也將從倒位等位基因中釋放出200kb長片段，測(cè)序reads與未重排等位基因不同的模式進(jìn)行拼接，其中第二切割位點(diǎn)和著絲粒LCR邊界之間的區(qū)域覆蓋率很高，該區(qū)域距離未重排的PMS2基因的位置約650kb。

HLS-CATCH技術(shù)平臺(tái)，是Sage Science 公司開發(fā)的SageHLS超長DNA片段回收儀結(jié)合CATCH（Cas9-assisted targeting of chromosome segments，Cas9輔助靶向染色體片段）技術(shù)構(gòu)成。首先，將核酸裝載到Sage HLS預(yù)制膠樣品孔中進(jìn)行電泳，完整的染色體DNA被截留在樣品孔中；關(guān)閉電泳并加入用于切除大部分PMS2區(qū)域的Cas9復(fù)合物(如圖2所示)；最后，消化產(chǎn)物通過儀器自帶的脈沖場電泳實(shí)現(xiàn)純化回收。繼而qPCR定性定量檢測(cè)回收產(chǎn)物，隨后在Illumina測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序分析結(jié)果見圖3。

圖2. HLS-CATCH技術(shù)平臺(tái)

圖3.目標(biāo)片段測(cè)序覆蓋情況

在基因組分析中，檢測(cè)長片段的倒位仍然是一個(gè)難題，其他方法如Strand-seq（Falconer等人，2012）、超長納米孔測(cè)序（Zhou等人，2020）和熒光標(biāo)測(cè)技術(shù)（Lam等人，2012年），都需要專門的DNA提取和處理步驟。本應(yīng)用中基于HLS-CATCH技術(shù)（SageHLS超長DNA片段回收儀結(jié)合CATCH（Cas9-assisted targeting of chromosome segments，Cas9輔助靶向染色體片段）），從細(xì)胞核（或細(xì)胞）中提取HMW DNA到Cas9酶切步驟全程自動(dòng)化完成。酶切產(chǎn)物的片段大小直接從HLS-CATCH洗脫回收。鑒于短讀長Illumina測(cè)序成功獲取檢測(cè)目標(biāo)片段的詳細(xì)情況，該方法也適用于其他由染色體重排、倒位、易位現(xiàn)象導(dǎo)致的疾病研究等。定制化基因組切割、片段大小篩選和短讀長Illumina測(cè)序的高覆蓋率分析運(yùn)用，使其成為一種相對(duì)簡單且具有成本效益的大片段倒位分析方法。

Detection of large inversions involving the Lynch syndrome genePMS2 using Cas9-assisted targeted sequencing. Chris Boles,Tina Huang, Feng Chen, Sage Science, Inc., Beverly, MA.,Illumina, Inc., Foster City, CA.

 

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