DNA甲基化+轉(zhuǎn)錄組綜合分析鑒定調(diào)控豬睪丸發(fā)育的潛在基因
DNA甲基化在調(diào)控基因表達(dá)和睪丸發(fā)育中發(fā)揮重要作用。WGBS 和 RNA-Seq 數(shù)據(jù)綜合分析可以繪制DNA甲基化與基因表達(dá)關(guān)系的全面圖譜，從而鑒定受甲基化影響的關(guān)鍵基因。如對(duì)小鼠睪丸組織中 WGBS 和 RNA-Seq 的分析揭示了與類固醇產(chǎn)生和精子發(fā)生相關(guān)的基因和通路，揭示了PM2.5如何通過(guò)甲基化破壞雄性生殖功能。對(duì)胚胎天鵝絨山羊皮膚樣本（胚胎第65天和胚胎第120天天鵝絨山羊）中的 WGBS 和 RNA-Seq 分析鑒定了對(duì)早期卵泡發(fā)育至關(guān)重要的基因和機(jī)制。然而，DNA 甲基化對(duì)豬睪丸發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)的作用仍不清楚。闡明這種作用對(duì)于了解雄性生殖發(fā)育中的基因表達(dá)變化至關(guān)重要。
近日，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所梅書棋和彭先文共同通訊在《International Journal of Molecular Sciences》（Int J Mol Sci）（IF:5.6）期刊發(fā)表題為“Comprehensive Analysis of Methylome and Transcriptome to Identify Potential Genes Regulating Porcine Testis Development”的研究成果。研究聚焦于豬睪丸發(fā)育過(guò)程中的DNA甲基化模式，以及這些模式如何與基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)。通過(guò)對(duì)豬發(fā)育過(guò)程中的睪丸組織進(jìn)行WGBS和RNA-Seq分析，篩選出關(guān)鍵候選差異甲基化基因（DMG）及其富集信號(hào)通路。為DNA甲基化探索及其潛在調(diào)控機(jī)制提供重要見(jiàn)解，促進(jìn)對(duì)雄性發(fā)育生物學(xué)的更深入理解，還為未來(lái)的生殖健康研究和治療提供了新視角。
本研究使用RNA測(cè)序（RNA-Seq）和全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）技術(shù)，檢測(cè)了60日齡（60d）和180日齡（180d）的豬睪丸組織中的差異表達(dá)基因（DEGs）及其甲基化水平。研究揭示了DNA甲基化主要發(fā)生在胞嘧啶-鳥嘌呤（CG）中，分析鑒定出106282個(gè)差異甲基化區(qū)域（DMRs），對(duì)應(yīng)于12385個(gè)差異甲基化基因（DMGs）。進(jìn)一步對(duì)RNA-Seq和WGBS數(shù)據(jù)的綜合分析揭示了1083個(gè)與DEGs表達(dá)呈負(fù)相關(guān)的DMGs。GO分析顯示這些基因在精子發(fā)生、生殖細(xì)胞發(fā)育和精子細(xì)胞分化中顯著富集。富集基因的篩選揭示高甲基化抑制ADAM30、ADAM3A、DPY19L2、H2BC1、MAK、RPL10L、SPATA16和YBX2的表達(dá)，而低甲基化則增強(qiáng)CACNA1I、CADM1、CTNNB1、JAM2和PAFAH1B3的表達(dá)。此外，通過(guò)亞硫酸鹽測(cè)序PCR（BSP）檢測(cè)關(guān)鍵基因ADAM3A、ADAM30、YBX2、JAM2、PAFAH1B3和CTNNB1的甲基化狀態(tài)。本研究為豬睪丸發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制提供了見(jiàn)解。
研究方法：
1. 使用WGBS技術(shù)對(duì)60日齡（60d）和180日齡（180d）的豬睪丸組織樣本進(jìn)行DNA甲基化分析。
2. 利用RNA-Seq技術(shù)分析同一組織樣本的基因表達(dá)。
3. 通過(guò)生物信息學(xué)工具對(duì)WGBS和RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，鑒定差異甲基化區(qū)域（DMRs）和差異表達(dá)基因（DEGs）。
4. 進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，以揭示DMRs相關(guān)基因的功能。
5. 使用實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）和亞硫酸鹽測(cè)序PCR（BSP）驗(yàn)證關(guān)鍵基因的表達(dá)和甲基化狀態(tài)。
結(jié)果圖形
（1）豬睪丸組織中的DNA甲基化模式
圖1：豬睪丸組織中DNA甲基化。
A. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。
B. 堆疊條形圖顯示60日齡和180日齡豬睪丸組織中三種不同甲基化類型（mCG、mCHG和mCHH；H=A、C或T）的平均比例。甲基化類型分別用綠色、橙色和藍(lán)色表示。
C. 小提琴圖描繪了三種不同序列環(huán)境（CG、CHG和CHH；H=A、C或T）中的甲基化密度。每一行表示一個(gè)不同的環(huán)境。Y軸表示甲基化密度，X軸代表不同的樣本（60日齡和180日齡）。
D. 小提琴圖展示三種不同序列環(huán)境（CG、CHG和CHH；H = A、C或T）中甲基化水平分布。
E. 60日齡與180日齡睪丸組織中不同基因組元件的甲基化水平。每一行表示一個(gè)不同的環(huán)境。X軸表示不同的基因組元件，Y軸表示甲基化水平。左側(cè)和右側(cè)面板分別顯示60日齡和180日齡睪丸組織的甲基化水平分布。綠色、紫色和黃色線條分別代表CG、CHG和CHH甲基化水平。
F. 60日齡與180日齡睪丸組織中上下游±2K區(qū)域的甲基化水平分布。
（2）DMR鑒定
圖2：豬睪丸組織中差異甲基化區(qū)域（DMRs）的鑒定。
A. CG、CHG和CHHDMR相關(guān)基因維恩圖。
B. CG環(huán)境中DMRs長(zhǎng)度分布。X軸表示DMRs長(zhǎng)度；Y軸表示每個(gè)長(zhǎng)度的密度，擬合曲線的DMRs長(zhǎng)度分布用紅色標(biāo)出。
C. CG環(huán)境中甲基化水平分布小提琴圖。X軸代表不同年齡組（60日齡和180日齡），Y軸代表平均甲基化水平的值。
D. CG環(huán)境中DMR錨定區(qū)域。X軸和Y軸分別表示不同基因區(qū)域和DMRs數(shù)量。
（3）DMG功能富集分析
圖3：差異甲基化基因（DMGs）的GO和KEGG分析。
A. 條形圖顯示CG中GO富集分析結(jié)果。Y軸描述不同的GO分析，X軸顯示DMGs數(shù)量。BP、CC和MF分別代表生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能。
B. KEGG通路富集散點(diǎn)圖示例。Y軸和X軸分別顯示通路名稱和基因比例。點(diǎn)大小表示DMGs數(shù)量，顏色對(duì)應(yīng)于不同的q值。
（4）DNA甲基化與差異表達(dá)基因（DEG）的關(guān)聯(lián)分析
B. CG環(huán)境中的DMGs與DEGs維恩圖，區(qū)分了與高甲基化（hyper）和低甲基化（hypo）相關(guān)基因，以及表達(dá)水平升高（up）和降低（down）的基因。
（5）與DEGs負(fù)相關(guān)DMG關(guān)鍵通路的富集
B. 散點(diǎn)圖展示了與DEGs負(fù)相關(guān)的DMGs的KEGG通路。
表1：從與DEGs負(fù)相關(guān)的DMGs中篩選睪丸發(fā)育候選基因。
（6）鑒定參與睪丸發(fā)育的基因
圖6：DMGs及其表達(dá)模式的驗(yàn)證。
A. 基因的RT-qPCR表達(dá)水平與RNA-Seq數(shù)據(jù)一致；高甲基化抑制基因表達(dá)，而低甲基化刺激基因表達(dá)。
B. BSP檢測(cè)到的DNA甲基化與WGBS數(shù)據(jù)一致。進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，β-actin為對(duì)照基因。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
參考文獻(xiàn)：
Feng Y, Zhang Y, Wu J, Qiao M, Zhou J, Xu Z, Li Z, Sun H, Peng X, Mei S. Comprehensive Analysis of Methylome and Transcriptome to Identify Potential Genes Regulating Porcine Testis Development. Int J Mol Sci. 2024 Aug 22;25(16) pii: ijms25169105. doi: 10.3390/ijms25169105. PubMed PMID: 39201790.
近日，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所梅書棋和彭先文共同通訊在《International Journal of Molecular Sciences》（Int J Mol Sci）（IF:5.6）期刊發(fā)表題為“Comprehensive Analysis of Methylome and Transcriptome to Identify Potential Genes Regulating Porcine Testis Development”的研究成果。研究聚焦于豬睪丸發(fā)育過(guò)程中的DNA甲基化模式，以及這些模式如何與基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)。通過(guò)對(duì)豬發(fā)育過(guò)程中的睪丸組織進(jìn)行WGBS和RNA-Seq分析，篩選出關(guān)鍵候選差異甲基化基因（DMG）及其富集信號(hào)通路。為DNA甲基化探索及其潛在調(diào)控機(jī)制提供重要見(jiàn)解，促進(jìn)對(duì)雄性發(fā)育生物學(xué)的更深入理解，還為未來(lái)的生殖健康研究和治療提供了新視角。
本研究使用RNA測(cè)序（RNA-Seq）和全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）技術(shù)，檢測(cè)了60日齡（60d）和180日齡（180d）的豬睪丸組織中的差異表達(dá)基因（DEGs）及其甲基化水平。研究揭示了DNA甲基化主要發(fā)生在胞嘧啶-鳥嘌呤（CG）中，分析鑒定出106282個(gè)差異甲基化區(qū)域（DMRs），對(duì)應(yīng)于12385個(gè)差異甲基化基因（DMGs）。進(jìn)一步對(duì)RNA-Seq和WGBS數(shù)據(jù)的綜合分析揭示了1083個(gè)與DEGs表達(dá)呈負(fù)相關(guān)的DMGs。GO分析顯示這些基因在精子發(fā)生、生殖細(xì)胞發(fā)育和精子細(xì)胞分化中顯著富集。富集基因的篩選揭示高甲基化抑制ADAM30、ADAM3A、DPY19L2、H2BC1、MAK、RPL10L、SPATA16和YBX2的表達(dá)，而低甲基化則增強(qiáng)CACNA1I、CADM1、CTNNB1、JAM2和PAFAH1B3的表達(dá)。此外，通過(guò)亞硫酸鹽測(cè)序PCR（BSP）檢測(cè)關(guān)鍵基因ADAM3A、ADAM30、YBX2、JAM2、PAFAH1B3和CTNNB1的甲基化狀態(tài)。本研究為豬睪丸發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制提供了見(jiàn)解。
研究方法：
1. 使用WGBS技術(shù)對(duì)60日齡（60d）和180日齡（180d）的豬睪丸組織樣本進(jìn)行DNA甲基化分析。
2. 利用RNA-Seq技術(shù)分析同一組織樣本的基因表達(dá)。
3. 通過(guò)生物信息學(xué)工具對(duì)WGBS和RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，鑒定差異甲基化區(qū)域（DMRs）和差異表達(dá)基因（DEGs）。
4. 進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，以揭示DMRs相關(guān)基因的功能。
5. 使用實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）和亞硫酸鹽測(cè)序PCR（BSP）驗(yàn)證關(guān)鍵基因的表達(dá)和甲基化狀態(tài)。
結(jié)果圖形
（1）豬睪丸組織中的DNA甲基化模式
圖1：豬睪丸組織中DNA甲基化。
B. 堆疊條形圖顯示60日齡和180日齡豬睪丸組織中三種不同甲基化類型（mCG、mCHG和mCHH；H=A、C或T）的平均比例。甲基化類型分別用綠色、橙色和藍(lán)色表示。
C. 小提琴圖描繪了三種不同序列環(huán)境（CG、CHG和CHH；H=A、C或T）中的甲基化密度。每一行表示一個(gè)不同的環(huán)境。Y軸表示甲基化密度，X軸代表不同的樣本（60日齡和180日齡）。
D. 小提琴圖展示三種不同序列環(huán)境（CG、CHG和CHH；H = A、C或T）中甲基化水平分布。
E. 60日齡與180日齡睪丸組織中不同基因組元件的甲基化水平。每一行表示一個(gè)不同的環(huán)境。X軸表示不同的基因組元件，Y軸表示甲基化水平。左側(cè)和右側(cè)面板分別顯示60日齡和180日齡睪丸組織的甲基化水平分布。綠色、紫色和黃色線條分別代表CG、CHG和CHH甲基化水平。
F. 60日齡與180日齡睪丸組織中上下游±2K區(qū)域的甲基化水平分布。
（2）DMR鑒定
圖2：豬睪丸組織中差異甲基化區(qū)域（DMRs）的鑒定。
B. CG環(huán)境中DMRs長(zhǎng)度分布。X軸表示DMRs長(zhǎng)度；Y軸表示每個(gè)長(zhǎng)度的密度，擬合曲線的DMRs長(zhǎng)度分布用紅色標(biāo)出。
C. CG環(huán)境中甲基化水平分布小提琴圖。X軸代表不同年齡組（60日齡和180日齡），Y軸代表平均甲基化水平的值。
D. CG環(huán)境中DMR錨定區(qū)域。X軸和Y軸分別表示不同基因區(qū)域和DMRs數(shù)量。
（3）DMG功能富集分析
圖3：差異甲基化基因（DMGs）的GO和KEGG分析。
B. KEGG通路富集散點(diǎn)圖示例。Y軸和X軸分別顯示通路名稱和基因比例。點(diǎn)大小表示DMGs數(shù)量，顏色對(duì)應(yīng)于不同的q值。
（4）DNA甲基化與差異表達(dá)基因（DEG）的關(guān)聯(lián)分析
圖4：DNA甲基化與基因表達(dá)之間的相關(guān)性分析。
A. DEGs和DMGs（CG、CHG和CHH環(huán)境）之間的重疊分析維恩圖。B. CG環(huán)境中的DMGs與DEGs維恩圖，區(qū)分了與高甲基化（hyper）和低甲基化（hypo）相關(guān)基因，以及表達(dá)水平升高（up）和降低（down）的基因。
（5）與DEGs負(fù)相關(guān)DMG關(guān)鍵通路的富集
圖5：與DEGs負(fù)相關(guān)的DMGs的功能富集分析。
A. 條形圖顯示了與DEGs負(fù)相關(guān)的DMGs的GO富集。B. 散點(diǎn)圖展示了與DEGs負(fù)相關(guān)的DMGs的KEGG通路。
表1：從與DEGs負(fù)相關(guān)的DMGs中篩選睪丸發(fā)育候選基因。
（6）鑒定參與睪丸發(fā)育的基因
圖6：DMGs及其表達(dá)模式的驗(yàn)證。
B. BSP檢測(cè)到的DNA甲基化與WGBS數(shù)據(jù)一致。進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，β-actin為對(duì)照基因。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
參考文獻(xiàn)：
Feng Y, Zhang Y, Wu J, Qiao M, Zhou J, Xu Z, Li Z, Sun H, Peng X, Mei S. Comprehensive Analysis of Methylome and Transcriptome to Identify Potential Genes Regulating Porcine Testis Development. Int J Mol Sci. 2024 Aug 22;25(16) pii: ijms25169105. doi: 10.3390/ijms25169105. PubMed PMID: 39201790.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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