ChIP-seq等揭示Foxo1-YAP-Notch1軸在疾病進(jìn)展中的表觀調(diào)控作用
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非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）是一種慢性肝臟疾病，其特征是肝臟中脂肪積累、炎癥和纖維化。干擾素基因刺激因子（stimulator of IFN genes，STING）是一種細(xì)胞質(zhì)DNA傳感器，與NASH中的炎癥激活有關(guān)。先天免疫激活對于NASH進(jìn)展期間引發(fā)肝臟炎癥至關(guān)重要，然而免疫調(diào)節(jié)分子如何識別脂肪生成、纖維化和炎癥信號的機(jī)制尚不清楚。
2024年8月9日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院肝臟外科徐東偉博士、Xiaoye Qu、Tao Yang為并列第一作者，徐東偉博士和美國加州大學(xué)洛杉磯分校大衛(wèi)格芬醫(yī)學(xué)院Bibo Ke為共同通訊作者研究了高脂飲食（high-fat diet，HFD）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激如何激活肝細(xì)胞中的Foxo1、YAP和Notch1信號，并研究這些信號如何影響NASH進(jìn)展。相關(guān)研究成果以“The Foxo1-YAP-Notch1 axis reprograms STING-mediated innate immunity in NASH progression”為題發(fā)表在《experimental and molecular medicine》雜志（EXP MOL MED）（IF 9.5）。
本研究揭示高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激激活了肝巨噬細(xì)胞中的Foxo1、YAP和Notch1信號。巨噬細(xì)胞Foxo1缺失（Foxo1M-KO）改善了HFD肝臟中的肝炎、脂肪肝和纖維化，減少了HFD肝臟中STING（stimulator of IFN genes）、TBK1（TANK-binding kinase 1）和NF-κB的激活。但Foxo1和YAP雙基因敲除（Foxo1/YAPM-DKO）或Foxo1和Notch1雙基因敲除（Foxo1/Notch1M-DKO）促進(jìn)了STING功能，并加劇HFD誘導(dǎo)的肝損傷。而Foxo1M-KO顯著降低了棕櫚酸（PA）和油酸（OA）刺激的Kupffer細(xì)胞釋放的TGF-β1，并在與Kupffer細(xì)胞共培養(yǎng)后的原代肝星狀細(xì)胞（HSCs）中介導(dǎo)Col1α1、CCL2和Timp1表達(dá)下調(diào)，但上調(diào)MMP1表達(dá)。Kupffer細(xì)胞中PA和OA增強(qiáng)了LIMD1和LATS1的共定位和互作，從而誘導(dǎo)YAP核轉(zhuǎn)位。Foxo1M-KO激活了PGC-1α并增加了細(xì)胞核YAP活性，調(diào)節(jié)線粒體生物合成。研究利用染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-Seq）以及原位RNA雜交，揭示了NICD與YAP共定位并靶向Mb21d1（cGAS），而YAP作為NICD的新輔助激活因子，對于NASH進(jìn)展中STING功能的重編程至關(guān)重要。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了巨噬細(xì)胞Foxo1–YAP–Notch1軸作為一個關(guān)鍵分子調(diào)控因子的重要性，該軸可以調(diào)控NASH中的脂質(zhì)代謝、炎癥和先天免疫。
實(shí)驗(yàn)方法：
使用基因敲除小鼠模型，通過24周高脂飲食喂養(yǎng)后，利用ChIP-seq、RNA-seq、RNA原位雜交、Western blot等方法研究了Foxo1、YAP和Notch1在巨噬細(xì)胞中的特異性敲除對肝臟病理變化的影響。
結(jié)果圖形：
（1）巨噬細(xì)胞中Foxo1敲除減少高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性和炎癥反應(yīng)。
為鑒定巨噬細(xì)胞Foxo1是否參與肝臟脂肪變性，研究分析了脂肪肝中Kupffer細(xì)胞的Foxo1表達(dá)。通過Western blot、免疫熒光染色、組織學(xué)染色、定量PCR等實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞中Foxo1缺失可以減少高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪變性和炎癥反應(yīng)。Foxo1在調(diào)控肝臟脂肪積累和炎癥過程中的作用表明巨噬細(xì)胞Foxo1在NASH的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，而調(diào)節(jié)Foxo1活性或表達(dá)可能為治療NASH提供一種新策略。
圖1：巨噬細(xì)胞Foxo1缺失減少了高脂飲食誘導(dǎo)的NASH中的肝臟脂肪變性和炎癥。
a. 在野生型（WT）小鼠被喂食高脂飲食（HFD）24周后，通過western blot分析揭示肝臟巨噬細(xì)胞中的核Foxo1、p-JNK、JNK、p-P65和P65蛋白表達(dá)上調(diào)。
b. 免疫熒光染色顯示脂肪肝中巨噬細(xì)胞Foxo1表達(dá)增加（每組n=6個樣本）。
c. Foxo1M-KO小鼠表現(xiàn)出較低的肝臟與體重比（每組n=6個樣本）。
d. Foxo1M-KO肝臟中肝甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）水平（每組n=6個樣本）降低。
e. 代表性的組織學(xué)染色（H&E和Oil Red O）顯示Foxo1M-KO減輕肝臟脂肪變性，并減少肝細(xì)胞氣球樣變和脂質(zhì)積累（每組n=6個樣本）。
f. 基于組織學(xué)圖像檢測的NAS（NAFLD活動評分）在Foxo1M-KO組中顯著降低（每組n=6個樣本）。
g. HFD喂養(yǎng)的Foxo1M-KO小鼠血清ALT和AST水平降低（IU/L）（每組n=6個樣本）。
h. 定量PCR顯示，脂肪肝中負(fù)責(zé)脂肪酸攝取和合成的基因Srebp1c、Slc27a1、Fabp1、CD36、Fas和Accα的水平顯著降低，而Cpt1α、Acox1和Acadm表達(dá)增加（每組n=6個樣本）。
（2）巨噬細(xì)胞Foxo1缺失抑制了 STING 介導(dǎo)的 HFD型NASH肝臟炎癥和纖維化
接下來研究人員分析了巨噬細(xì)胞 Foxo1 是否影響 HFD 誘導(dǎo)NASH 中的 STING 激活和肝纖維化。數(shù)據(jù)結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞Foxo1信號對于調(diào)控HFD誘導(dǎo)的NASH中STING介導(dǎo)的肝臟炎癥和纖維化至關(guān)重要。
b. 免疫熒光染色顯示，在Foxo1M-KO小鼠經(jīng)過24周的HFD喂養(yǎng)后，肝臟中CD11b陽性巨噬細(xì)胞減少（每組n=6個樣本）。
c. 定量RT-PCR顯示，在Foxo1M-KO小鼠經(jīng)過24周的HFD喂養(yǎng)后，TNF-α、IL-1β、IL-6和CXCL-10水平降低，而IL-10的水平在Foxo1M-KO小鼠中增加（每組n=6個樣本）。
d. 代表性的組織學(xué)和免疫組化染色（Sirius Red、Masson和α-SMA）顯示Foxo1M-KO小鼠的HFD肝臟中肝纖維化減少（每組n=6個樣本）。
e. 定量RT-PCR顯示脂肪肝中Foxo1M-KO小鼠的α-SMA、Col1a1、CCL2和Timp1表達(dá)減少（每組n=6個樣本）。
f. 肝臟Kupffer細(xì)胞先用0.2 mM棕櫚酸（PA）和0.4 mM油酸（OA）混合物刺激24小時，然后與原代肝星狀細(xì)胞（HSCs）共培養(yǎng)。與Foxo1FL/FL相比，F(xiàn)oxo1M-KO顯著減少了PA/OA刺激的巨噬細(xì)胞在共培養(yǎng)上清中TGF-β1的釋放（每組n=4個樣本）。
g. 共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)HSC水平的Col1α1、CCL2、Timp1 mRNA減少，MMP1增加（每組n=4個樣本）。
（3）巨噬細(xì)胞Foxo1敲除促進(jìn)Notch1和Hippo信號通路響應(yīng)HFD
接下來，作者研究了巨噬細(xì)胞Foxo1是否影響對響應(yīng)HFD的基因表達(dá)和信號通路。對照組Foxo1FL/FL和敲除組Foxo1M-KO小鼠經(jīng)過24周HFD喂養(yǎng)后，從小鼠中分離出肝臟巨噬細(xì)胞，并進(jìn)行深度RNA測序（RNA-seq）分析。分析結(jié)果表明，與Foxo1FL/FL對照組相比，F(xiàn)oxo1M-KO組HFD巨噬細(xì)胞中912個基因表達(dá)發(fā)生顯著變化（415個上調(diào)和497個下調(diào)）（圖3a）。GO分析顯示Foxo1M-KO中與炎癥反應(yīng)、先天免疫反應(yīng)、細(xì)胞脂質(zhì)代謝過程等多個基因表達(dá)發(fā)生變化（圖3b，c）。KEGG分析揭示了與Notch信號通路、脂肪酸代謝、PPAR信號通路、AMPK信號通路、Hippo信號通路及細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體互作相關(guān)的基因表達(dá)的富集（圖3d，e）。Notch1和Hippo信號通路相關(guān)基因，如Hes1、Hey1、Fosl1、Ccnd1、Nr4a2、Ccnb1和Erbb2，在HFD喂養(yǎng)的Foxo1M-KO動物的巨噬細(xì)胞中顯著激活，且通過定量RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證。這些結(jié)果表明Notch1和Hippo通路在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞Foxo1驅(qū)動的NASH進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。
圖3：巨噬細(xì)胞中Foxo1敲除在響應(yīng)高脂飲食（HFD）時促進(jìn)了Notch1和Hippo信號通路。Foxo1FL/FL和Foxo1M-KO小鼠經(jīng)過24周HFD喂養(yǎng)后，從它們的肝臟巨噬細(xì)胞中提取了總RNA，隨后進(jìn)行RNA-seq。
a. Foxo1M-KO小鼠與Foxo1FL/FL對照組相比，在HFD肝臟巨噬細(xì)胞中的基因表達(dá)的log2倍數(shù)變化。HFD肝臟巨噬細(xì)胞中的差異表達(dá)基因（DEGs）（n=912，P<0.05）被標(biāo)記出來（紅色表示上調(diào)，n=415；綠色表示下調(diào)，n=497）。
b-c. Foxo1M-KO小鼠的HFD肝臟巨噬細(xì)胞的GO富集分析，包括細(xì)胞成分和生物過程。
d. KEGG通路富集分析，分析了Foxo1M-KO小鼠的HFD肝臟巨噬細(xì)胞中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本。
e. Foxo1M-KO小鼠的HFD肝臟巨噬細(xì)胞中表達(dá)變化的基因熱圖。
（4）巨噬細(xì)胞Foxo1敲除在HFD誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中增加了YAP/NICD活性并抑制STING激活
由于Hippo通路及其效應(yīng)蛋白YAP（一個轉(zhuǎn)錄輔激活因子），已被確認(rèn)為調(diào)控基因功能的重要信號級聯(lián)，作者隨后研究了HFD誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是否影響NASH進(jìn)展中的YAP和Notch1的細(xì)胞內(nèi)域（NICD）。
a. HFD喂養(yǎng)后，巨噬細(xì)胞中的核YAP和NICD表達(dá)顯著增加。
b. 從WT小鼠中分離的肝臟巨噬細(xì)胞用0.2 mM棕櫚酸（PA）和0.4 mM油酸（OA）混合物刺激24小時。PA/OA刺激激活了JNK，并增加了巨噬細(xì)胞中核Foxo1和PGC-1α的表達(dá)。
c. PA和OA刺激增加了p-LATS1和LIMD1表達(dá)，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)YAP磷酸化減少和核YAP表達(dá)增加。
d. 免疫熒光染色顯示PA/OA刺激的巨噬細(xì)胞中巨噬細(xì)胞LIMD1（綠色）和LATS1（紅色）的共定位。
e. 免疫共沉淀分析顯示PA/OA刺激增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞中LIMD1和LATS1的共定位和互作。
f. WT小鼠的肝臟巨噬細(xì)胞在PA/OA刺激后轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9介導(dǎo)的LIMD1 KO或?qū)φ蛰d體。此外LIMD1 KO增加了細(xì)胞質(zhì)YAP磷酸化并減少核YAP表達(dá)。
g. 巨噬細(xì)胞Foxo1敲除顯著增加了PGC-1α、YAP和NICD水平，并在PA/OA刺激后下調(diào)p-STING表達(dá)。
h. Foxo1M-KO小鼠的肝臟巨噬細(xì)胞在PA/OA刺激后轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9介導(dǎo)的PGC-1α KO或?qū)φ蛰d體。免疫共沉淀分析揭示Foxo1M-KO細(xì)胞中CRISPR/Cas9介導(dǎo)的PGC-1α KO減少了YAP與NICD互作并增加p-STING表達(dá)。
（5）YAP-NICD互作靶向cGAS并調(diào)節(jié)STING介導(dǎo)的炎癥
HFD誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激增加了JNK依賴性Foxo1轉(zhuǎn)錄活性和LIMD1介導(dǎo)的YAP核轉(zhuǎn)位，并激活Notch1信號，作者進(jìn)一步研究其中的潛在分子機(jī)制。
圖 5：YAP–NICD互作靶向cGAS并調(diào)節(jié)STING介導(dǎo)的炎癥。
a. 免疫熒光染色顯示，在PA/OA刺激后巨噬細(xì)胞核內(nèi)YAP（綠色）和NICD（紅色）的共定位。
b. 免疫共沉淀分析顯示，F(xiàn)oxo1敲除增加了YAP與Foxo1M-KO巨噬細(xì)胞中NICD的結(jié)合。
c. NICD ChIP-seq分析的實(shí)驗(yàn)設(shè)計。骨髓源性巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophages，BMMs）在與PA/OA共培養(yǎng)24小時后收集并固定。在染色質(zhì)剪切和NICD抗體選擇后，沉淀的DNA片段由NICD蛋白復(fù)合物進(jìn)行測序。
d. 在小鼠Mb21d1（cGAS）基因上的NICD結(jié)合位點(diǎn)的定位。顯示了9號染色體上小鼠cGAS基因的5個外顯子、4個內(nèi)含子、3'非翻譯區(qū)（UTR）、5'UTR和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）。
e. NICD和YAP與cGAS啟動子結(jié)合的ChIP-PCR分析。
f. RNA原位雜交分析顯示，在PA/OA刺激后Foxo1FL/FL巨噬細(xì)胞中目標(biāo)基因cGAS的轉(zhuǎn)錄表達(dá)增加（每組n=4個樣本）。
g. 脂肪酸刺激增加了Foxo1FL/FL或Foxo1M-KO小鼠的PA刺激的Foxo1FL/FL巨噬細(xì)胞中cGAS、p-STING、p-TBK1和p-P65的表達(dá)，而Foxo1敲除減少了cGAS、p-STING、p-TBK1和p-P65的表達(dá)。
h. qRT-PCR分析顯示，在暴露于PA/OA的巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和CXCL-10水平降低（每組n=4個樣本）。
ChIP-seq分析揭示了YAP–NICD軸靶向cGAS并調(diào)節(jié)對PA/OA刺激的STING介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
（6）HFD誘導(dǎo)的NASH中巨噬細(xì)胞Notch1信號通路破壞激活了cGAS并增加STING介導(dǎo)的肝臟炎癥和纖維化。
為了闡明Notch激活在巨噬細(xì)胞Foxo1信號介導(dǎo)的NASH免疫調(diào)節(jié)中的作用機(jī)制，作者制備了骨髓特異性Foxo1和Notch1雙敲除（Foxo1/Notch1M-DKO）小鼠。
圖6：巨噬細(xì)胞Notch1信號通路的破壞激活了cGAS并增加了HFD誘導(dǎo)的NASH中STING介導(dǎo)的肝臟炎癥和纖維化。
a. 24周HFD喂養(yǎng)后，F(xiàn)oxo1/Notch1M-DKO增加了脂肪肝中cGAS、p-STING、p-TBK1、p-P65以及核PGC-1α、LIMD1和YAP的表達(dá)。
b. 免疫熒光染色顯示Foxo1/Notch1M-DKO增加了脂肪肝中CD11b陽性巨噬細(xì)胞的積累（每組n=6個樣本）。
c. Foxo1/Notch1M-DKO增加了脂肪肝中TNF-α、IL-1β、IL-6和CXCL-10的表達(dá)，并降低了IL-10水平（每組n=6個樣本）。
d. HFD喂養(yǎng)的Foxo1/Notch1M-DKO小鼠的肝臟/體重比顯著增加（每組n=6個樣本）。
e. HFD喂養(yǎng)的Foxo1/Notch1M-DKO小鼠的TG和TC（mg/g）脂質(zhì)水平顯著增加（每組n=6個樣本）。
f. 代表性組織學(xué)染色（H&E和Oil Red O）顯示HFD喂養(yǎng)的Foxo1/Notch1M-DKO小鼠的肝臟表現(xiàn)出增加的脂質(zhì)積累（每組n=6個樣本）。
g. 基于組織學(xué)圖像檢測的NAS（NAFLD活動評分）在Foxo1/Notch1M-DKO組顯著增加（每組n=6個樣本）。
h. HFD喂養(yǎng)的Foxo1/Notch1M-DKO小鼠的血清ALT和AST水平增加（IU/L）（每組n=6個樣本）。
i. 代表性的組織學(xué)和免疫組化染色（Sirius Red和Masson）顯示Foxo1/Notch1M-DKO小鼠的脂肪肝組織中肝纖維化增強(qiáng)（每組n=6個樣本）。
j. 在HFD喂養(yǎng)后，F(xiàn)oxo1/Notch1M-DKO肝臟中包括αSMA、Col1α1、TGF-β1、CCL2和TIMP1在內(nèi)的促纖維化基因的mRNA表達(dá)增加（每組n=6個樣本）。
Foxo1/Notch1M-DKO激活了cGAS，增加了STING介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并加劇了HFD誘導(dǎo)的NASH中的肝纖維化。
（7）YAP是巨噬細(xì)胞中Foxo1介導(dǎo)的STING功能免疫調(diào)節(jié)在脂毒性誘導(dǎo)的線粒體氧化應(yīng)激中所必需的。 在證明了巨噬細(xì)胞YAP-NICD互作在調(diào)節(jié)HFD誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中STING功能的關(guān)鍵作用之后，作者進(jìn)一步在體外研究了YAP在免疫和代謝調(diào)節(jié)中的機(jī)制作用。
圖 7：YAP是巨噬細(xì)胞Foxo1介導(dǎo)的STING功能免疫調(diào)節(jié)在脂毒性誘導(dǎo)的線粒體氧化應(yīng)激中所必需的。從Foxo1M-KO小鼠中分離的骨髓源性巨噬細(xì)胞（BMMs），轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9介導(dǎo)的YAP基因敲除（p-CRISPR-YAP KO）或?qū)φ蛰d體，然后在與0.2 mM棕櫚酸（PA）和0.4 mM油酸（OA）混合物孵育24小時后，與原代肝細(xì)胞共培養(yǎng)。
a. CRISPR/Cas9介導(dǎo)的YAP基因敲除增強(qiáng)了PA刺激的巨噬細(xì)胞中cGAS、p-STING、p-TBK1和p-P65的表達(dá)。
b. 在PA和OA刺激的Foxo1M-KO巨噬細(xì)胞中，IL-6、TNF-α、CCL2和IL-β的mRNA水平升高。
c. ELISA分析顯示，在p-CRISPR-YAP-KO細(xì)胞中HMGB1的釋放顯著增加，而在對照細(xì)胞中沒有增加（每組n=4個樣本）。
d. 免疫熒光染色顯示，p-CRISPR-YAP KO在Foxo1M-KO巨噬細(xì)胞中增加了與PA/OA共培養(yǎng)后肝細(xì)胞的ROS產(chǎn)生（每組n=4個樣本）。定量ROS產(chǎn)生巨噬細(xì)胞（綠色）。
e. 在與p-CRISPR-YAP KO轉(zhuǎn)染的Foxo1M-KO巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，肝細(xì)胞中TFAM、COX-1和UCP3的表達(dá)降低。
f. 定量RT-PCR分析顯示，p-CRISPR-YAP KO減少了與p-CRISPR-YAP KO或?qū)φ蛰d體轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后肝細(xì)胞中的mtDNA水平（每組n=4個樣本）。
g. Oil Red O染色顯示，在與p-CRISPR-YAP-KO或?qū)φ蛰d體轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，肝細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)脂質(zhì)增加（每組n=4個樣本）。
（8）Foxo1–YAP軸調(diào)控HFD誘導(dǎo)的NASH中STING介導(dǎo)的肝臟炎癥和脂肪變性。
接下來，作者分析了Foxo1–YAP軸在調(diào)節(jié)NASH中脂質(zhì)代謝和STING介導(dǎo)的炎癥中的作用。
圖 8：Foxo1–YAP軸調(diào)節(jié)HFD誘導(dǎo)的NASH中STING介導(dǎo)的肝臟炎癥和脂肪變性。
a. 代表性的組織學(xué)染色（H&E和Oil Red O）顯示，F(xiàn)oxo1M-KO小鼠表現(xiàn)出脂質(zhì)積累減少，而Foxo1/YAPM-DKO小鼠在24周HFD喂養(yǎng)后表現(xiàn)出肝臟脂肪變性增加（每組n=6個樣本）。
b. 基于組織學(xué)圖像測量的NAS（NAFLD活動評分）在Foxo1/YAPM-DKO組顯著增加（每組n=6個樣本）。
c. Foxo1/YAPM-DKO小鼠的肝臟/體重比顯著更高（每組n=6個樣本）。
d. Foxo1/YAPM-DKO小鼠的TG和TC水平（mg/g）顯著增加（每組n=6個樣本）。
e. Foxo1/YAPM-DKO小鼠表現(xiàn)出顯著增加的血清ALT和AST水平（IU/L）（每組n=6個樣本）。
f. 代表性的免疫熒光和免疫組化圖像（α-SMA和Masson）顯示Foxo1/YAPM-DKO肝臟的肝纖維化顯著增加（每組n=6個樣本）。
g. 定量RT-PCR分析顯示Foxo1/YAPM-DKO脂肪肝中cGAS、p-STING、p-TBK1和p-P65的表達(dá)上調(diào)（每組n=6個樣本）。
h. Western blot分析揭示Foxo1/YAPM-DKO在脂肪肝中cGAS、p-STING、p-TBK1和p-P65的表達(dá)增加，且核PGC-1α、LIMD1和NICD的表達(dá)增加。
i. 免疫熒光染色顯示，在缺血肝臟中CD11b陽性巨噬細(xì)胞的積累增加（每組n=6個樣本）。
j. 在脂肪肝的Foxo1/YAPM-DKO肝臟中，TNF-α、IL-1β、IL-6和CXCL-10的mRNA水平增加，而IL-10水平降低（每組n=6個樣本）。
HFD誘導(dǎo)的NASH小鼠Foxo1/YAPM-DKO加劇了STING介導(dǎo)的肝臟炎癥、脂肪變性和纖維化。
參考文獻(xiàn)：
Xu D, Qu X, Yang T, Sheng M, Bian X, Zhan Y, Tian Y, Lin Y, Jin Y, Wang X, Ke M, Jiang L, Li C, Xia Q, Farmer DG, Ke B. The Foxo1-YAP-Notch1 axis reprograms STING-mediated innate immunity in NASH progression. Exp Mol Med. 2024 Aug 9. pii: 10.1038/s12276-024-01280-5. doi: 10.1038/s12276-024-01280-5. PubMed PMID: 39122845.
非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）是一種慢性肝臟疾病，其特征是肝臟中脂肪積累、炎癥和纖維化。干擾素基因刺激因子（stimulator of IFN genes，STING）是一種細(xì)胞質(zhì)DNA傳感器，與NASH中的炎癥激活有關(guān)。先天免疫激活對于NASH進(jìn)展期間引發(fā)肝臟炎癥至關(guān)重要，然而免疫調(diào)節(jié)分子如何識別脂肪生成、纖維化和炎癥信號的機(jī)制尚不清楚。
2024年8月9日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院肝臟外科徐東偉博士、Xiaoye Qu、Tao Yang為并列第一作者，徐東偉博士和美國加州大學(xué)洛杉磯分校大衛(wèi)格芬醫(yī)學(xué)院Bibo Ke為共同通訊作者研究了高脂飲食（high-fat diet，HFD）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激如何激活肝細(xì)胞中的Foxo1、YAP和Notch1信號，并研究這些信號如何影響NASH進(jìn)展。相關(guān)研究成果以“The Foxo1-YAP-Notch1 axis reprograms STING-mediated innate immunity in NASH progression”為題發(fā)表在《experimental and molecular medicine》雜志（EXP MOL MED）（IF 9.5）。
本研究揭示高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激激活了肝巨噬細(xì)胞中的Foxo1、YAP和Notch1信號。巨噬細(xì)胞Foxo1缺失（Foxo1M-KO）改善了HFD肝臟中的肝炎、脂肪肝和纖維化，減少了HFD肝臟中STING（stimulator of IFN genes）、TBK1（TANK-binding kinase 1）和NF-κB的激活。但Foxo1和YAP雙基因敲除（Foxo1/YAPM-DKO）或Foxo1和Notch1雙基因敲除（Foxo1/Notch1M-DKO）促進(jìn)了STING功能，并加劇HFD誘導(dǎo)的肝損傷。而Foxo1M-KO顯著降低了棕櫚酸（PA）和油酸（OA）刺激的Kupffer細(xì)胞釋放的TGF-β1，并在與Kupffer細(xì)胞共培養(yǎng)后的原代肝星狀細(xì)胞（HSCs）中介導(dǎo)Col1α1、CCL2和Timp1表達(dá)下調(diào)，但上調(diào)MMP1表達(dá)。Kupffer細(xì)胞中PA和OA增強(qiáng)了LIMD1和LATS1的共定位和互作，從而誘導(dǎo)YAP核轉(zhuǎn)位。Foxo1M-KO激活了PGC-1α并增加了細(xì)胞核YAP活性，調(diào)節(jié)線粒體生物合成。研究利用染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-Seq）以及原位RNA雜交，揭示了NICD與YAP共定位并靶向Mb21d1（cGAS），而YAP作為NICD的新輔助激活因子，對于NASH進(jìn)展中STING功能的重編程至關(guān)重要。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了巨噬細(xì)胞Foxo1–YAP–Notch1軸作為一個關(guān)鍵分子調(diào)控因子的重要性，該軸可以調(diào)控NASH中的脂質(zhì)代謝、炎癥和先天免疫。
實(shí)驗(yàn)方法：
使用基因敲除小鼠模型，通過24周高脂飲食喂養(yǎng)后，利用ChIP-seq、RNA-seq、RNA原位雜交、Western blot等方法研究了Foxo1、YAP和Notch1在巨噬細(xì)胞中的特異性敲除對肝臟病理變化的影響。
結(jié)果圖形：
（1）巨噬細(xì)胞中Foxo1敲除減少高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性和炎癥反應(yīng)。
為鑒定巨噬細(xì)胞Foxo1是否參與肝臟脂肪變性，研究分析了脂肪肝中Kupffer細(xì)胞的Foxo1表達(dá)。通過Western blot、免疫熒光染色、組織學(xué)染色、定量PCR等實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞中Foxo1缺失可以減少高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪變性和炎癥反應(yīng)。Foxo1在調(diào)控肝臟脂肪積累和炎癥過程中的作用表明巨噬細(xì)胞Foxo1在NASH的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，而調(diào)節(jié)Foxo1活性或表達(dá)可能為治療NASH提供一種新策略。
圖1：巨噬細(xì)胞Foxo1缺失減少了高脂飲食誘導(dǎo)的NASH中的肝臟脂肪變性和炎癥。
b. 免疫熒光染色顯示脂肪肝中巨噬細(xì)胞Foxo1表達(dá)增加（每組n=6個樣本）。
c. Foxo1M-KO小鼠表現(xiàn)出較低的肝臟與體重比（每組n=6個樣本）。
d. Foxo1M-KO肝臟中肝甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）水平（每組n=6個樣本）降低。
e. 代表性的組織學(xué)染色（H&E和Oil Red O）顯示Foxo1M-KO減輕肝臟脂肪變性，并減少肝細(xì)胞氣球樣變和脂質(zhì)積累（每組n=6個樣本）。
f. 基于組織學(xué)圖像檢測的NAS（NAFLD活動評分）在Foxo1M-KO組中顯著降低（每組n=6個樣本）。
g. HFD喂養(yǎng)的Foxo1M-KO小鼠血清ALT和AST水平降低（IU/L）（每組n=6個樣本）。
h. 定量PCR顯示，脂肪肝中負(fù)責(zé)脂肪酸攝取和合成的基因Srebp1c、Slc27a1、Fabp1、CD36、Fas和Accα的水平顯著降低，而Cpt1α、Acox1和Acadm表達(dá)增加（每組n=6個樣本）。
（2）巨噬細(xì)胞Foxo1缺失抑制了 STING 介導(dǎo)的 HFD型NASH肝臟炎癥和纖維化
接下來研究人員分析了巨噬細(xì)胞 Foxo1 是否影響 HFD 誘導(dǎo)NASH 中的 STING 激活和肝纖維化。數(shù)據(jù)結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞Foxo1信號對于調(diào)控HFD誘導(dǎo)的NASH中STING介導(dǎo)的肝臟炎癥和纖維化至關(guān)重要。
圖2：巨噬細(xì)胞中Foxo1敲除抑制了HFD誘導(dǎo)的NASH中STING介導(dǎo)的肝臟炎癥和纖維化。
a. 在Foxo1M-KO小鼠經(jīng)過24周的HFD喂養(yǎng)后，肝臟中p-STING、p-TBK1和p-P65的表達(dá)減少。b. 免疫熒光染色顯示，在Foxo1M-KO小鼠經(jīng)過24周的HFD喂養(yǎng)后，肝臟中CD11b陽性巨噬細(xì)胞減少（每組n=6個樣本）。
c. 定量RT-PCR顯示，在Foxo1M-KO小鼠經(jīng)過24周的HFD喂養(yǎng)后，TNF-α、IL-1β、IL-6和CXCL-10水平降低，而IL-10的水平在Foxo1M-KO小鼠中增加（每組n=6個樣本）。
d. 代表性的組織學(xué)和免疫組化染色（Sirius Red、Masson和α-SMA）顯示Foxo1M-KO小鼠的HFD肝臟中肝纖維化減少（每組n=6個樣本）。
e. 定量RT-PCR顯示脂肪肝中Foxo1M-KO小鼠的α-SMA、Col1a1、CCL2和Timp1表達(dá)減少（每組n=6個樣本）。
f. 肝臟Kupffer細(xì)胞先用0.2 mM棕櫚酸（PA）和0.4 mM油酸（OA）混合物刺激24小時，然后與原代肝星狀細(xì)胞（HSCs）共培養(yǎng)。與Foxo1FL/FL相比，F(xiàn)oxo1M-KO顯著減少了PA/OA刺激的巨噬細(xì)胞在共培養(yǎng)上清中TGF-β1的釋放（每組n=4個樣本）。
g. 共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)HSC水平的Col1α1、CCL2、Timp1 mRNA減少，MMP1增加（每組n=4個樣本）。
（3）巨噬細(xì)胞Foxo1敲除促進(jìn)Notch1和Hippo信號通路響應(yīng)HFD
接下來，作者研究了巨噬細(xì)胞Foxo1是否影響對響應(yīng)HFD的基因表達(dá)和信號通路。對照組Foxo1FL/FL和敲除組Foxo1M-KO小鼠經(jīng)過24周HFD喂養(yǎng)后，從小鼠中分離出肝臟巨噬細(xì)胞，并進(jìn)行深度RNA測序（RNA-seq）分析。分析結(jié)果表明，與Foxo1FL/FL對照組相比，F(xiàn)oxo1M-KO組HFD巨噬細(xì)胞中912個基因表達(dá)發(fā)生顯著變化（415個上調(diào)和497個下調(diào)）（圖3a）。GO分析顯示Foxo1M-KO中與炎癥反應(yīng)、先天免疫反應(yīng)、細(xì)胞脂質(zhì)代謝過程等多個基因表達(dá)發(fā)生變化（圖3b，c）。KEGG分析揭示了與Notch信號通路、脂肪酸代謝、PPAR信號通路、AMPK信號通路、Hippo信號通路及細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體互作相關(guān)的基因表達(dá)的富集（圖3d，e）。Notch1和Hippo信號通路相關(guān)基因，如Hes1、Hey1、Fosl1、Ccnd1、Nr4a2、Ccnb1和Erbb2，在HFD喂養(yǎng)的Foxo1M-KO動物的巨噬細(xì)胞中顯著激活，且通過定量RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證。這些結(jié)果表明Notch1和Hippo通路在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞Foxo1驅(qū)動的NASH進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。
圖3：巨噬細(xì)胞中Foxo1敲除在響應(yīng)高脂飲食（HFD）時促進(jìn)了Notch1和Hippo信號通路。Foxo1FL/FL和Foxo1M-KO小鼠經(jīng)過24周HFD喂養(yǎng)后，從它們的肝臟巨噬細(xì)胞中提取了總RNA，隨后進(jìn)行RNA-seq。
b-c. Foxo1M-KO小鼠的HFD肝臟巨噬細(xì)胞的GO富集分析，包括細(xì)胞成分和生物過程。
d. KEGG通路富集分析，分析了Foxo1M-KO小鼠的HFD肝臟巨噬細(xì)胞中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本。
e. Foxo1M-KO小鼠的HFD肝臟巨噬細(xì)胞中表達(dá)變化的基因熱圖。
（4）巨噬細(xì)胞Foxo1敲除在HFD誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中增加了YAP/NICD活性并抑制STING激活
由于Hippo通路及其效應(yīng)蛋白YAP（一個轉(zhuǎn)錄輔激活因子），已被確認(rèn)為調(diào)控基因功能的重要信號級聯(lián)，作者隨后研究了HFD誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是否影響NASH進(jìn)展中的YAP和Notch1的細(xì)胞內(nèi)域（NICD）。
圖4：巨噬細(xì)胞中Foxo1敲除在HFD誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中增加了YAP/NICD活性并抑制STING激活。
a. HFD喂養(yǎng)后，巨噬細(xì)胞中的核YAP和NICD表達(dá)顯著增加。
b. 從WT小鼠中分離的肝臟巨噬細(xì)胞用0.2 mM棕櫚酸（PA）和0.4 mM油酸（OA）混合物刺激24小時。PA/OA刺激激活了JNK，并增加了巨噬細(xì)胞中核Foxo1和PGC-1α的表達(dá)。
c. PA和OA刺激增加了p-LATS1和LIMD1表達(dá)，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)YAP磷酸化減少和核YAP表達(dá)增加。
d. 免疫熒光染色顯示PA/OA刺激的巨噬細(xì)胞中巨噬細(xì)胞LIMD1（綠色）和LATS1（紅色）的共定位。
e. 免疫共沉淀分析顯示PA/OA刺激增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞中LIMD1和LATS1的共定位和互作。
f. WT小鼠的肝臟巨噬細(xì)胞在PA/OA刺激后轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9介導(dǎo)的LIMD1 KO或?qū)φ蛰d體。此外LIMD1 KO增加了細(xì)胞質(zhì)YAP磷酸化并減少核YAP表達(dá)。
g. 巨噬細(xì)胞Foxo1敲除顯著增加了PGC-1α、YAP和NICD水平，并在PA/OA刺激后下調(diào)p-STING表達(dá)。
h. Foxo1M-KO小鼠的肝臟巨噬細(xì)胞在PA/OA刺激后轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9介導(dǎo)的PGC-1α KO或?qū)φ蛰d體。免疫共沉淀分析揭示Foxo1M-KO細(xì)胞中CRISPR/Cas9介導(dǎo)的PGC-1α KO減少了YAP與NICD互作并增加p-STING表達(dá)。
（5）YAP-NICD互作靶向cGAS并調(diào)節(jié)STING介導(dǎo)的炎癥
HFD誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激增加了JNK依賴性Foxo1轉(zhuǎn)錄活性和LIMD1介導(dǎo)的YAP核轉(zhuǎn)位，并激活Notch1信號，作者進(jìn)一步研究其中的潛在分子機(jī)制。
圖 5：YAP–NICD互作靶向cGAS并調(diào)節(jié)STING介導(dǎo)的炎癥。
b. 免疫共沉淀分析顯示，F(xiàn)oxo1敲除增加了YAP與Foxo1M-KO巨噬細(xì)胞中NICD的結(jié)合。
c. NICD ChIP-seq分析的實(shí)驗(yàn)設(shè)計。骨髓源性巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophages，BMMs）在與PA/OA共培養(yǎng)24小時后收集并固定。在染色質(zhì)剪切和NICD抗體選擇后，沉淀的DNA片段由NICD蛋白復(fù)合物進(jìn)行測序。
d. 在小鼠Mb21d1（cGAS）基因上的NICD結(jié)合位點(diǎn)的定位。顯示了9號染色體上小鼠cGAS基因的5個外顯子、4個內(nèi)含子、3'非翻譯區(qū)（UTR）、5'UTR和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）。
e. NICD和YAP與cGAS啟動子結(jié)合的ChIP-PCR分析。
f. RNA原位雜交分析顯示，在PA/OA刺激后Foxo1FL/FL巨噬細(xì)胞中目標(biāo)基因cGAS的轉(zhuǎn)錄表達(dá)增加（每組n=4個樣本）。
g. 脂肪酸刺激增加了Foxo1FL/FL或Foxo1M-KO小鼠的PA刺激的Foxo1FL/FL巨噬細(xì)胞中cGAS、p-STING、p-TBK1和p-P65的表達(dá)，而Foxo1敲除減少了cGAS、p-STING、p-TBK1和p-P65的表達(dá)。
h. qRT-PCR分析顯示，在暴露于PA/OA的巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和CXCL-10水平降低（每組n=4個樣本）。
ChIP-seq分析揭示了YAP–NICD軸靶向cGAS并調(diào)節(jié)對PA/OA刺激的STING介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
（6）HFD誘導(dǎo)的NASH中巨噬細(xì)胞Notch1信號通路破壞激活了cGAS并增加STING介導(dǎo)的肝臟炎癥和纖維化。
為了闡明Notch激活在巨噬細(xì)胞Foxo1信號介導(dǎo)的NASH免疫調(diào)節(jié)中的作用機(jī)制，作者制備了骨髓特異性Foxo1和Notch1雙敲除（Foxo1/Notch1M-DKO）小鼠。
圖6：巨噬細(xì)胞Notch1信號通路的破壞激活了cGAS并增加了HFD誘導(dǎo)的NASH中STING介導(dǎo)的肝臟炎癥和纖維化。
b. 免疫熒光染色顯示Foxo1/Notch1M-DKO增加了脂肪肝中CD11b陽性巨噬細(xì)胞的積累（每組n=6個樣本）。
c. Foxo1/Notch1M-DKO增加了脂肪肝中TNF-α、IL-1β、IL-6和CXCL-10的表達(dá)，并降低了IL-10水平（每組n=6個樣本）。
d. HFD喂養(yǎng)的Foxo1/Notch1M-DKO小鼠的肝臟/體重比顯著增加（每組n=6個樣本）。
e. HFD喂養(yǎng)的Foxo1/Notch1M-DKO小鼠的TG和TC（mg/g）脂質(zhì)水平顯著增加（每組n=6個樣本）。
f. 代表性組織學(xué)染色（H&E和Oil Red O）顯示HFD喂養(yǎng)的Foxo1/Notch1M-DKO小鼠的肝臟表現(xiàn)出增加的脂質(zhì)積累（每組n=6個樣本）。
g. 基于組織學(xué)圖像檢測的NAS（NAFLD活動評分）在Foxo1/Notch1M-DKO組顯著增加（每組n=6個樣本）。
h. HFD喂養(yǎng)的Foxo1/Notch1M-DKO小鼠的血清ALT和AST水平增加（IU/L）（每組n=6個樣本）。
i. 代表性的組織學(xué)和免疫組化染色（Sirius Red和Masson）顯示Foxo1/Notch1M-DKO小鼠的脂肪肝組織中肝纖維化增強(qiáng)（每組n=6個樣本）。
j. 在HFD喂養(yǎng)后，F(xiàn)oxo1/Notch1M-DKO肝臟中包括αSMA、Col1α1、TGF-β1、CCL2和TIMP1在內(nèi)的促纖維化基因的mRNA表達(dá)增加（每組n=6個樣本）。
Foxo1/Notch1M-DKO激活了cGAS，增加了STING介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并加劇了HFD誘導(dǎo)的NASH中的肝纖維化。
（7）YAP是巨噬細(xì)胞中Foxo1介導(dǎo)的STING功能免疫調(diào)節(jié)在脂毒性誘導(dǎo)的線粒體氧化應(yīng)激中所必需的。 在證明了巨噬細(xì)胞YAP-NICD互作在調(diào)節(jié)HFD誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中STING功能的關(guān)鍵作用之后，作者進(jìn)一步在體外研究了YAP在免疫和代謝調(diào)節(jié)中的機(jī)制作用。
圖 7：YAP是巨噬細(xì)胞Foxo1介導(dǎo)的STING功能免疫調(diào)節(jié)在脂毒性誘導(dǎo)的線粒體氧化應(yīng)激中所必需的。從Foxo1M-KO小鼠中分離的骨髓源性巨噬細(xì)胞（BMMs），轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9介導(dǎo)的YAP基因敲除（p-CRISPR-YAP KO）或?qū)φ蛰d體，然后在與0.2 mM棕櫚酸（PA）和0.4 mM油酸（OA）混合物孵育24小時后，與原代肝細(xì)胞共培養(yǎng)。
b. 在PA和OA刺激的Foxo1M-KO巨噬細(xì)胞中，IL-6、TNF-α、CCL2和IL-β的mRNA水平升高。
c. ELISA分析顯示，在p-CRISPR-YAP-KO細(xì)胞中HMGB1的釋放顯著增加，而在對照細(xì)胞中沒有增加（每組n=4個樣本）。
d. 免疫熒光染色顯示，p-CRISPR-YAP KO在Foxo1M-KO巨噬細(xì)胞中增加了與PA/OA共培養(yǎng)后肝細(xì)胞的ROS產(chǎn)生（每組n=4個樣本）。定量ROS產(chǎn)生巨噬細(xì)胞（綠色）。
e. 在與p-CRISPR-YAP KO轉(zhuǎn)染的Foxo1M-KO巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，肝細(xì)胞中TFAM、COX-1和UCP3的表達(dá)降低。
f. 定量RT-PCR分析顯示，p-CRISPR-YAP KO減少了與p-CRISPR-YAP KO或?qū)φ蛰d體轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后肝細(xì)胞中的mtDNA水平（每組n=4個樣本）。
g. Oil Red O染色顯示，在與p-CRISPR-YAP-KO或?qū)φ蛰d體轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，肝細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)脂質(zhì)增加（每組n=4個樣本）。
（8）Foxo1–YAP軸調(diào)控HFD誘導(dǎo)的NASH中STING介導(dǎo)的肝臟炎癥和脂肪變性。
接下來，作者分析了Foxo1–YAP軸在調(diào)節(jié)NASH中脂質(zhì)代謝和STING介導(dǎo)的炎癥中的作用。
圖 8：Foxo1–YAP軸調(diào)節(jié)HFD誘導(dǎo)的NASH中STING介導(dǎo)的肝臟炎癥和脂肪變性。
b. 基于組織學(xué)圖像測量的NAS（NAFLD活動評分）在Foxo1/YAPM-DKO組顯著增加（每組n=6個樣本）。
c. Foxo1/YAPM-DKO小鼠的肝臟/體重比顯著更高（每組n=6個樣本）。
d. Foxo1/YAPM-DKO小鼠的TG和TC水平（mg/g）顯著增加（每組n=6個樣本）。
e. Foxo1/YAPM-DKO小鼠表現(xiàn)出顯著增加的血清ALT和AST水平（IU/L）（每組n=6個樣本）。
f. 代表性的免疫熒光和免疫組化圖像（α-SMA和Masson）顯示Foxo1/YAPM-DKO肝臟的肝纖維化顯著增加（每組n=6個樣本）。
g. 定量RT-PCR分析顯示Foxo1/YAPM-DKO脂肪肝中cGAS、p-STING、p-TBK1和p-P65的表達(dá)上調(diào)（每組n=6個樣本）。
h. Western blot分析揭示Foxo1/YAPM-DKO在脂肪肝中cGAS、p-STING、p-TBK1和p-P65的表達(dá)增加，且核PGC-1α、LIMD1和NICD的表達(dá)增加。
i. 免疫熒光染色顯示，在缺血肝臟中CD11b陽性巨噬細(xì)胞的積累增加（每組n=6個樣本）。
j. 在脂肪肝的Foxo1/YAPM-DKO肝臟中，TNF-α、IL-1β、IL-6和CXCL-10的mRNA水平增加，而IL-10水平降低（每組n=6個樣本）。
HFD誘導(dǎo)的NASH小鼠Foxo1/YAPM-DKO加劇了STING介導(dǎo)的肝臟炎癥、脂肪變性和纖維化。
參考文獻(xiàn)：
Xu D, Qu X, Yang T, Sheng M, Bian X, Zhan Y, Tian Y, Lin Y, Jin Y, Wang X, Ke M, Jiang L, Li C, Xia Q, Farmer DG, Ke B. The Foxo1-YAP-Notch1 axis reprograms STING-mediated innate immunity in NASH progression. Exp Mol Med. 2024 Aug 9. pii: 10.1038/s12276-024-01280-5. doi: 10.1038/s12276-024-01280-5. PubMed PMID: 39122845.
標(biāo)簽：
ChIP-seq
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