植物組學(xué)時(shí)代的DNA甲基化研究在群體表觀遺傳學(xué)中的應(yīng)用
DNA甲基化在許多生物過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。得益于數(shù)十年來(lái)對(duì)DNA甲基化突變體的研究，如今對(duì)DNA甲基化的建立和維持機(jī)制有了很好的理解，尤其在擬南芥（Arabidopsis thaliana）的Col-0品系中的研究。最近的研究利用自然品系甲基化組進(jìn)行的全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWASs）從群體水平上揭示了DNA甲基化變化的復(fù)雜而獨(dú)特的遺傳基礎(chǔ)。亞硫酸鹽處理后的測(cè)序是量化DNA甲基化的杰出方法，此外最近開(kāi)發(fā)的無(wú)亞硫酸鹽檢測(cè)甲基化方法，以及同時(shí)檢測(cè)遺傳和表觀遺傳信息的具有成本效益的方法。本文還討論了特定擬南芥品系中DNA甲基化的可塑性，DNA甲基化在植物適應(yīng)環(huán)境中的作用，以及自然群體中DNA甲基化變化的遺傳決定因素。最近開(kāi)發(fā)的技術(shù)和知識(shí)將極大地促進(jìn)未來(lái)在群體表觀基因組學(xué)領(lǐng)域的研究。
DNA甲基化全基因組檢測(cè)技術(shù)
基于亞硫酸鹽的二代測(cè)序
DNA甲基化研究的第一步是在特定位點(diǎn)或全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)和定量甲基化水平。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了數(shù)十種方法，在這些方法中，基于亞硫酸鹽的方法使用最為廣泛。全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）已成為在單堿基分辨率下定量檢測(cè)DNA甲基化的金標(biāo)準(zhǔn)。亞硫酸鹽處理DNA時(shí)，會(huì)將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則保持不變。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，未甲基化的胞嘧啶在測(cè)序時(shí)會(huì)呈現(xiàn)為胸腺嘧啶。將WGBS數(shù)據(jù)與參考序列比對(duì)后，根據(jù)特定位點(diǎn)上胸腺嘧啶比例鑒定每個(gè)胞嘧啶的甲基化水平。為準(zhǔn)確定量甲基化水平，WGBS覆蓋度要求通常比基于單核苷酸多態(tài)性鑒定的全基因組測(cè)序（WGS）更高�？赡軙�(huì)限制WGBS在群體水平上對(duì)大基因組物種的應(yīng)用，如玉米（Zea mays）（2.1 Gb）和小麥（Triticum aestivum，14.5Gb）。為克服這一限制開(kāi)發(fā)出多種替代策略來(lái)捕獲目標(biāo)基因組區(qū)域的DNA甲基化，如簡(jiǎn)化基因組亞硫酸鹽測(cè)序（RRBS）、甲基化DNA免疫沉淀測(cè)序（MeDIP-seq）、全基因組DNA甲基化芯片以及修飾胞嘧啶轉(zhuǎn)化捕獲方法。
不基于亞硫酸鹽的甲基化測(cè)序
基于亞硫酸鹽測(cè)序方法的局限在于文庫(kù)制備和甲基化比對(duì)中的固有偏差，這主要是由于在胞嘧啶轉(zhuǎn)化反應(yīng)過(guò)程中亞硫酸鹽處理?xiàng)l件嚴(yán)格，難以將短讀長(zhǎng)唯一比對(duì)到包含重復(fù)DNA序列的基因組區(qū)域。偏差可能是未甲基化胞嘧啶富集的基因組區(qū)域更快降解、胞嘧啶轉(zhuǎn)化不完全以及由堿基含量偏倚引起的PCR偏差。近年來(lái)為減少這種偏差，開(kāi)發(fā)許多無(wú)亞硫酸鹽策略，如通過(guò)第三代測(cè)序或基于酶促反應(yīng)的測(cè)序技術(shù)。
圖1：用于定量檢測(cè)DNA甲基化的無(wú)亞硫酸鹽方法。
A) Nanopore長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序。
B) SMRT長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序。
C-E) 兩種基于酶促的測(cè)序方法。
同時(shí)檢測(cè)遺傳和表觀遺傳信息
MethylSaferSeqS和5-letter-seq能夠同時(shí)檢測(cè)遺傳信息和甲基化狀態(tài)。與亞硫酸鹽文庫(kù)制備相比，MethylSaferSeqS在PCR后將分離原始DNA模板和擴(kuò)增產(chǎn)物，分別用作后續(xù)WGBS和WGS的input文庫(kù)。而5-letter-seq在單個(gè)文庫(kù)中保留了遺傳和表觀遺傳信息，將片段化DNA的兩端連接到含有尿嘧啶殘基的發(fā)夾接頭上，隨后使用尿嘧啶特異性切除試劑處理，將兩條DNA鏈分開(kāi)；合成cDNA鏈后，得到的擴(kuò)增子形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，一條鏈包含原始的表觀遺傳信息，互補(bǔ)鏈保留遺傳信息。在與測(cè)序接頭連接后，甲基化胞嘧啶通過(guò)TET和BGT被APOBEC3A保護(hù)免受氧化，而未甲基化胞嘧啶則通過(guò)APOBEC3A和UvrD解旋酶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。甲基化胞嘧啶保持不變，未甲基化胞嘧啶在最終的測(cè)序reads片段被轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶。根據(jù)解碼規(guī)則，可以從每個(gè)發(fā)夾的測(cè)序reads片段中區(qū)分甲基化和未甲基化胞嘧啶。5-letter-seq可以在單個(gè)文庫(kù)中確定遺傳序列和DNA甲基化水平，大幅降低群體中甲基化研究成本。這些方法在群體表觀基因組學(xué)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力，該領(lǐng)域需要關(guān)于基因突變和甲基化模式信息，特別對(duì)于大基因組物種。
單細(xì)胞DNA甲基化分析
在活細(xì)胞中，DNA胞嘧啶應(yīng)該處于兩種狀態(tài)之一（即甲基化或未甲基化）。然而，由于細(xì)胞異質(zhì)性和組織及個(gè)體樣本混合，甲基化水平經(jīng)常在未甲基化到完全甲基化之間定量變化。在過(guò)去十年中，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了十多種方法，用于從單一細(xì)胞中分析哺乳動(dòng)物的DNA甲基化，包括單細(xì)胞簡(jiǎn)化亞硫酸鹽測(cè)序（scRRBS）、單細(xì)胞亞硫酸鹽測(cè)序（scBS-seq）、單細(xì)胞CpG島甲基化測(cè)序（scCGI-seq）；Smart-RRBS用于單個(gè)細(xì)胞中的DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組分析；單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序技術(shù)（scNOMeRe-seq）用于從同一個(gè)單細(xì)胞中同時(shí)進(jìn)行染色質(zhì)可及性、DNA甲基化和RNA表達(dá)的全基因組分析。與哺乳動(dòng)物中這些技術(shù)的快速發(fā)展相比，植物中單細(xì)胞DNA甲基化的分析進(jìn)展要慢得多。雖然植物中的大多數(shù)單細(xì)胞研究都集中在轉(zhuǎn)錄組上，但有研究使用亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的隨機(jī)整合片段測(cè)序（BRIF-seq）揭示了玉米中4個(gè)四分體的16個(gè)微孢子的單細(xì)胞DNA甲基化組。WGBS結(jié)合熒光激活細(xì)胞分選，已經(jīng)允許揭示特定細(xì)胞類(lèi)型的DNA甲基化組，包括6種不同的根分生組織細(xì)胞群、精子和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、莖和非莖的芽分生組織細(xì)胞。這些研究揭示了植物細(xì)胞的異質(zhì)性和不同細(xì)胞類(lèi)型中DNA甲基化的動(dòng)態(tài)變化。
DNA甲基化可塑性
擬南芥品系Col-0的DNA甲基化變化
在個(gè)體水平上，DNA甲基化動(dòng)態(tài)變化，并且可以在來(lái)自同一祖先的植物代際間變化，也可以在不同實(shí)驗(yàn)室中同一植物的不同組織以及來(lái)自相同組織的細(xì)胞之間變化。不同實(shí)驗(yàn)室中Col-0基因組DNA甲基化水平差異在CG中高達(dá)10%、在非CG甲基化區(qū)域達(dá)到7%。DNA甲基化模式表現(xiàn)出與上下文（CG、CHG、CHH）背景差異，在發(fā)育的各個(gè)階段觀察到CG甲基化穩(wěn)定、CHG甲基化增加、CHH甲基化減少。且與發(fā)育相關(guān)的大多數(shù)甲基化變化發(fā)生在著絲粒轉(zhuǎn)座元件（TEs）中。
圖 2. DNA甲基化可塑性及其對(duì)植物適應(yīng)環(huán)境中的作用。
A. 來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)室的50個(gè)高質(zhì)量WGBS數(shù)據(jù)集的野生型(WT)擬南芥Col-0的全基因組平均CG和CHG甲基化水平。
B. 通過(guò)比較4種組織的DNA甲基化數(shù)據(jù)鑒定的CG DMCs分布。
C. 來(lái)自9種根細(xì)胞類(lèi)型的100 kb窗口中CG、CHG和CHH甲基化水平的主成分分析(PCA)。RT，根尖；EP，表皮；CO，皮層；EN，內(nèi)皮層；ST，髓；CRC，柱狀根帽；LC，下柱狀。
D. DNA甲基化對(duì)植物對(duì)免疫啟動(dòng)的敏感性。
E. IAA27的DNA甲基化變化與CLSY1的基因突變相結(jié)合，影響側(cè)根發(fā)育并賦予其對(duì)低鉀環(huán)境的適應(yīng)。"T"形實(shí)線表示DNA甲基化增加抑制IAA27表達(dá)。"T"形虛線表示IAA27表達(dá)負(fù)調(diào)控側(cè)根發(fā)育，較粗線條表示更高表達(dá)抑制作用更強(qiáng)。
F. 在暴露于UVB后，UVR8-DRM2模塊誘導(dǎo)的DNA甲基化減少激活了下游基因/TEs。虛線框表示UVR8和DRM2之間的物理作用位點(diǎn)。"T"形實(shí)線表示抑制了DRM2介導(dǎo)的DNA甲基化，較粗線條具有更強(qiáng)抑制作用。
相比之下，組織（如根和莖）之間的甲基化模式差異呈動(dòng)態(tài)變化，其中在常染色質(zhì)區(qū)域的CG甲基化和著絲粒區(qū)域的非CG甲基化變化具有顯著差異。這種表觀基因組的可塑性主要?dú)w因于自發(fā)的表觀遺傳變化。與基因突變相比，表觀遺傳變化的發(fā)生率高得多，且在擬南芥基因組中已經(jīng)鑒定出表觀遺傳突變熱點(diǎn)區(qū)域。盡管這些區(qū)域只占基因組中CG位點(diǎn)的約12%，但在這些熱點(diǎn)區(qū)域觀察到約63%的表觀遺傳突變事件。甲基化模式差異的另一個(gè)重要因子是甲基化機(jī)制的組織/細(xì)胞特異性表達(dá)。已知有十個(gè)基因參與表觀遺傳調(diào)控，包括DNA甲基化減少1（DDM1）、ARGONAUTE 9（AGO9）和SU(VAR)3-9同源物4（SUVH4），這些基因在干細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。CLASSY家族基因表現(xiàn)出組織特異性表達(dá)模式；這些蛋白以組織特異性方式調(diào)控24-nt siRNA產(chǎn)生和DNA甲基化�；钚訢NA去甲基化是組織間差異性甲基化的另一因素，擬南芥DNA去甲基化由4個(gè)DEMETER家族成員—DME、DML2、DML3和ROS1調(diào)控，野生型中鑒定出的許多組織特異性甲基化變化在這4個(gè)基因的四重突變體中都不存在。
響應(yīng)環(huán)境的DNA甲基化變化
越來(lái)越多的研究表明，DNA甲基化作為一種可遺傳的胞嘧啶修飾，能夠響應(yīng)并適應(yīng)各種生物和非生物脅迫。本文重點(diǎn)描述DNA甲基化在植物適應(yīng)生物和非生物脅迫中重要作用的最新研究。
雖然基因突變賦予了植物長(zhǎng)期適應(yīng)性，但DNA甲基化可以快速響應(yīng)環(huán)境挑戰(zhàn)并迅速提高適應(yīng)度。Sheikh等人（2023年）發(fā)現(xiàn)了接頭組蛋白H1和DNA甲基化在植物防御中的重要作用。由于植物防御基因表達(dá)變化，一個(gè)含有3種組蛋白H1變體（h1.1、h1.2、h1.3）的擬南芥三重突變體表現(xiàn)出對(duì)植物病原體感染抗性增強(qiáng)。在病原體感染之前使用22-氨基酸鞭毛蛋白（flg22）進(jìn)行預(yù)處理的啟動(dòng)過(guò)程增強(qiáng)了野生型植物對(duì)隨后病原體感染抗性。然而h1突變體對(duì)啟動(dòng)不敏感。flg22處理導(dǎo)致h1防御基因啟動(dòng)子中的DNA甲基化增加，從而導(dǎo)致其抑制。這項(xiàng)研究表明，DNA甲基化可以快速響應(yīng)病原體感染，并通過(guò)調(diào)控防御基因表達(dá)影響植物防御。
DNA甲基化也可以在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中增強(qiáng)植物的適應(yīng)性，無(wú)論是依賴(lài)或獨(dú)立于基因突變。Shahzad等人（2020年）最近研究表明，DNA甲基化變化與基因突變相結(jié)合，允許植物響應(yīng)鉀缺乏。對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的感知和反應(yīng)對(duì)植物至關(guān)重要，必需營(yíng)養(yǎng)素鉀的缺乏可能導(dǎo)致根系發(fā)育不良。不同的擬南芥品系已經(jīng)進(jìn)化出2種策略，通過(guò)增加主根或側(cè)根的生長(zhǎng)來(lái)克服低鉀脅迫。Shahzad等人（2020年）使用全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）鑒定出CLSY1作為低鉀條件下側(cè)根發(fā)育的調(diào)控因子。低鉀抑制了吲哚-3-乙酸誘導(dǎo)27（IAA27）的降解，IAA27通過(guò)生長(zhǎng)素信號(hào)通路負(fù)向調(diào)控根分枝。同時(shí)CLSY1可以通過(guò)DNA甲基化沉默IAA27。在CLSY1的538位點(diǎn)上，天冬氨酸到谷氨酸變化與自然擬南芥品系中低鉀條件下側(cè)根發(fā)育顯著相關(guān)。攜帶編碼天冬氨酸的CLSY1等位基因品系在IAA27啟動(dòng)子上的DNA甲基化水平顯著增加，與攜帶編碼谷氨酸的等位基因品系相比，IAA27表達(dá)水平顯著下調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)表明，DNA甲基化可以協(xié)調(diào)遺傳變化，并促進(jìn)側(cè)根發(fā)育，使植物能夠克服具有挑戰(zhàn)性的環(huán)境。
盡管DNA甲基化已被認(rèn)為與植物適應(yīng)有關(guān)，但證據(jù)大多來(lái)自顯示DNA甲基化變化與環(huán)境變化相關(guān)的研究。Jiang等人（2021年）提供了直接證據(jù)來(lái)說(shuō)明紫外線照射如何抑制DNA甲基化。擬南芥中的DNA甲基化通過(guò)UVB光響應(yīng)，主要通過(guò)UV RESISTANCE LOCUS 8（UVR8，一種UVB光受體）和DRM2（一種新的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶）之間的物理互作實(shí)現(xiàn)。UVB照射通過(guò)UVR8依賴(lài)性通路誘導(dǎo)全基因組DNA低甲基化并解除轉(zhuǎn)座元件（TEs）抑制。這種UVR8-DRM2介導(dǎo)的TEs重新激活機(jī)制可能直接或間接調(diào)控參與植物抵御紫外線照射的關(guān)鍵基因表達(dá)。
自然群體中DNA甲基化變化的遺傳基礎(chǔ)
對(duì)特定基因組位點(diǎn)以及不同擬南芥品系的全基因組甲基化組的研究顯示，自然品系間的DNA甲基化存在顯著差異。與在個(gè)別品系中已充分描述的DNA甲基化建立和維持的調(diào)控因子相比，自然品系間DNA甲基化變化的遺傳和分子機(jī)制了解甚少。GWAS已經(jīng)鑒定出此過(guò)程的多個(gè)影響因子，其中CMT2因全基因組非CG甲基化水平、差異甲基化區(qū)域（DMRs）和CMT2靶向的轉(zhuǎn)座元件（TEs）被多個(gè)GWAS定位。這與CMT2作為負(fù)責(zé)維持CHH甲基化的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶功能以及CHH和CHG甲基化之間的強(qiáng)相關(guān)性相吻合。另一個(gè)TEs上CHH甲基化的主要決定因子是NRPE1，它編碼RNA聚合酶V的最大亞基，是RNA介導(dǎo)DNA甲基化（RdDM）通路的關(guān)鍵組分。NRPE1在調(diào)控TEs移動(dòng)性方面的作用也通過(guò)GWAS揭示。
在一項(xiàng)GWAS中，miR823A通常與CHG DMRs相關(guān)。將CHH甲基化作為協(xié)變量后，另一項(xiàng)RdDM/CMT2靶向TEs的CHG甲基化的GWAS鑒定出CMT3和miR823A。CMT3編碼負(fù)責(zé)維持CHG甲基化的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，而miR823A編碼的microRNA823A預(yù)計(jì)靶向CMT3。這些發(fā)現(xiàn)表明miR823A-CMT3模塊介導(dǎo)的CHG甲基化調(diào)控可能，但還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。
包括AGO9和AGO1在內(nèi)的ARGONAUTE基因被鑒定為自然群體中RdDM靶向TEs的CHH甲基化調(diào)控因子。這些基因在這些品系中的功能可能與Col-0中AGO9功能不同，因?yàn)閍go9突變體在RdDM靶向的低甲基化區(qū)域（hypo-DMR）的甲基化沒(méi)有變化。這表明在Col-0中沒(méi)有參與RdDM通路的AGO蛋白可能在其他品系中參與DNA甲基化。
MULTICOPY SUPPRESSOR OF IRA1（MSI1）編碼Polycomb抑制復(fù)合體2（PRC2）的一個(gè)亞基，該亞基催化組蛋白3賴(lài)氨酸27位點(diǎn)的三甲基化（H3K27me3）。在兩項(xiàng)最近的GWAS中，MSI1與44個(gè)DMR區(qū)域的CHG甲基化以及RdDM和CMT2靶向的TEs相關(guān)。在Col-0背景下，H3K27me3與DNA甲基化無(wú)關(guān)，與CMT3對(duì)CHG甲基化所必需的H3K9me2不同。這些發(fā)現(xiàn)表明在其他品系中DNA甲基化和H3K27me3之間可能存在相關(guān)性，這有待進(jìn)一步表征。
盡管沒(méi)有被重復(fù)鑒定，JUMONJI26（JMJ26）—BONSAI METHYLATION 1（IBM1）的同源物基因突變被報(bào)告與使用CHH作為協(xié)變量的條件GWAS中RdDM靶向TEs的CHG甲基化相關(guān)聯(lián)。敲除JMJ26導(dǎo)致RdDM靶向TEs的CHG甲基化增加。鑒定JMJ26的關(guān)鍵是在CHG甲基化的GWAS時(shí)將CHH甲基化作為協(xié)變量的條件分析。這一發(fā)現(xiàn)突出了GWAS在群體表觀遺傳學(xué)研究中的創(chuàng)新潛力，包括研究方法或群體構(gòu)建。
除了轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子外，大量的基因突變，無(wú)論是鄰近還是遠(yuǎn)端，已被證明與靶位點(diǎn)的DNA甲基化變化相關(guān)聯(lián)。盡管如此，關(guān)于這些關(guān)聯(lián)背后的因果基因突變知之甚少，因?yàn)檫�沒(méi)有驗(yàn)證這些關(guān)聯(lián)背后的遺傳變化。一些研究表明，諸如TE插入和結(jié)構(gòu)變異（SVs）的基因突變可以影響附近位點(diǎn)的DNA甲基化。Ahmed等人（2011年）發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有匹配24-nt siRNA的數(shù)百個(gè)TEs通過(guò)鄰近密集甲基化的TEs甲基化擴(kuò)散獲得DNA甲基化。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在211個(gè)擬南芥品系中，近一半的新TE插入位點(diǎn)在帶有TE插入的品系中高度甲基化并擴(kuò)散到鄰近區(qū)域。直接證據(jù)來(lái)自CEN180重復(fù)序列在常染色質(zhì)靶位點(diǎn)的從頭沉積，從而在ibm1突變體中誘導(dǎo)局部DNA甲基化的建立和擴(kuò)散。在擬南芥1001個(gè)甲基化組中，大部分SVs（22%至50%）的甲基化存在差異，表明了SV對(duì)鄰近序列DNA甲基化的影響。SV如何影響DNA甲基化的最好例子是擬南芥中的PHOSPHORIBOSYLANTHRANILATE ISOMERASE（PAI）基因家族（PAI1至PAI4），一些品系包含未甲基化的PAI基因，如Col，而其他品系包含甲基化的PAI基因，如WS。Col包含3個(gè)不連鎖的PAI基因（PAI1、PAI2和PAI3），而WS包含4個(gè)PAI基因，具有PAI1至PAI4的倒置重復(fù)。這個(gè)倒置重復(fù)導(dǎo)致所有4個(gè)PAI基因甲基化。
易小結(jié)
最近的全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWASs)為理解轉(zhuǎn)座元件(TEs)非CG甲基化的自然變異的遺傳基礎(chǔ)提供了重要信息。然而目前對(duì)CG甲基化的遺傳基礎(chǔ)以及其他基因組特征（如啟動(dòng)子區(qū)域和蛋白質(zhì)編碼基因）的DNA甲基化了解仍然知之甚少。高通量檢測(cè)和驗(yàn)證表觀遺傳變化的功能，以及將這些變化在作物育種項(xiàng)目中的應(yīng)用，是未來(lái)重要的研究工作。在群體水平上的包含多組學(xué)數(shù)據(jù)集的全基因組染色質(zhì)圖譜的可用性，無(wú)疑將加深對(duì)表觀遺傳變化的理解。結(jié)合大數(shù)據(jù)分析與表觀遺傳編輯技術(shù)，用于挖掘和應(yīng)用表觀遺傳變化，將極大增強(qiáng)作物育種項(xiàng)目。
未解決的問(wèn)題
Liu J, Zhong X. Population epigenetics: DNA methylation in the plant omics era. Plant Physiol. 2024 Feb 16. pii: 7609601. doi: 10.1093/plphys/kiae089. PubMed PMID: 38366882.
DNA甲基化全基因組檢測(cè)技術(shù)
基于亞硫酸鹽的二代測(cè)序
DNA甲基化研究的第一步是在特定位點(diǎn)或全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)和定量甲基化水平。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了數(shù)十種方法，在這些方法中，基于亞硫酸鹽的方法使用最為廣泛。全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）已成為在單堿基分辨率下定量檢測(cè)DNA甲基化的金標(biāo)準(zhǔn)。亞硫酸鹽處理DNA時(shí)，會(huì)將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則保持不變。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，未甲基化的胞嘧啶在測(cè)序時(shí)會(huì)呈現(xiàn)為胸腺嘧啶。將WGBS數(shù)據(jù)與參考序列比對(duì)后，根據(jù)特定位點(diǎn)上胸腺嘧啶比例鑒定每個(gè)胞嘧啶的甲基化水平。為準(zhǔn)確定量甲基化水平，WGBS覆蓋度要求通常比基于單核苷酸多態(tài)性鑒定的全基因組測(cè)序（WGS）更高�？赡軙�(huì)限制WGBS在群體水平上對(duì)大基因組物種的應(yīng)用，如玉米（Zea mays）（2.1 Gb）和小麥（Triticum aestivum，14.5Gb）。為克服這一限制開(kāi)發(fā)出多種替代策略來(lái)捕獲目標(biāo)基因組區(qū)域的DNA甲基化，如簡(jiǎn)化基因組亞硫酸鹽測(cè)序（RRBS）、甲基化DNA免疫沉淀測(cè)序（MeDIP-seq）、全基因組DNA甲基化芯片以及修飾胞嘧啶轉(zhuǎn)化捕獲方法。
不基于亞硫酸鹽的甲基化測(cè)序
基于亞硫酸鹽測(cè)序方法的局限在于文庫(kù)制備和甲基化比對(duì)中的固有偏差，這主要是由于在胞嘧啶轉(zhuǎn)化反應(yīng)過(guò)程中亞硫酸鹽處理?xiàng)l件嚴(yán)格，難以將短讀長(zhǎng)唯一比對(duì)到包含重復(fù)DNA序列的基因組區(qū)域。偏差可能是未甲基化胞嘧啶富集的基因組區(qū)域更快降解、胞嘧啶轉(zhuǎn)化不完全以及由堿基含量偏倚引起的PCR偏差。近年來(lái)為減少這種偏差，開(kāi)發(fā)許多無(wú)亞硫酸鹽策略，如通過(guò)第三代測(cè)序或基于酶促反應(yīng)的測(cè)序技術(shù)。
表1：全基因組DNA甲基化定量方法比較
圖1：用于定量檢測(cè)DNA甲基化的無(wú)亞硫酸鹽方法。
B) SMRT長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序。
C-E) 兩種基于酶促的測(cè)序方法。
同時(shí)檢測(cè)遺傳和表觀遺傳信息
MethylSaferSeqS和5-letter-seq能夠同時(shí)檢測(cè)遺傳信息和甲基化狀態(tài)。與亞硫酸鹽文庫(kù)制備相比，MethylSaferSeqS在PCR后將分離原始DNA模板和擴(kuò)增產(chǎn)物，分別用作后續(xù)WGBS和WGS的input文庫(kù)。而5-letter-seq在單個(gè)文庫(kù)中保留了遺傳和表觀遺傳信息，將片段化DNA的兩端連接到含有尿嘧啶殘基的發(fā)夾接頭上，隨后使用尿嘧啶特異性切除試劑處理，將兩條DNA鏈分開(kāi)；合成cDNA鏈后，得到的擴(kuò)增子形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，一條鏈包含原始的表觀遺傳信息，互補(bǔ)鏈保留遺傳信息。在與測(cè)序接頭連接后，甲基化胞嘧啶通過(guò)TET和BGT被APOBEC3A保護(hù)免受氧化，而未甲基化胞嘧啶則通過(guò)APOBEC3A和UvrD解旋酶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。甲基化胞嘧啶保持不變，未甲基化胞嘧啶在最終的測(cè)序reads片段被轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶。根據(jù)解碼規(guī)則，可以從每個(gè)發(fā)夾的測(cè)序reads片段中區(qū)分甲基化和未甲基化胞嘧啶。5-letter-seq可以在單個(gè)文庫(kù)中確定遺傳序列和DNA甲基化水平，大幅降低群體中甲基化研究成本。這些方法在群體表觀基因組學(xué)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力，該領(lǐng)域需要關(guān)于基因突變和甲基化模式信息，特別對(duì)于大基因組物種。
單細(xì)胞DNA甲基化分析
在活細(xì)胞中，DNA胞嘧啶應(yīng)該處于兩種狀態(tài)之一（即甲基化或未甲基化）。然而，由于細(xì)胞異質(zhì)性和組織及個(gè)體樣本混合，甲基化水平經(jīng)常在未甲基化到完全甲基化之間定量變化。在過(guò)去十年中，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了十多種方法，用于從單一細(xì)胞中分析哺乳動(dòng)物的DNA甲基化，包括單細(xì)胞簡(jiǎn)化亞硫酸鹽測(cè)序（scRRBS）、單細(xì)胞亞硫酸鹽測(cè)序（scBS-seq）、單細(xì)胞CpG島甲基化測(cè)序（scCGI-seq）；Smart-RRBS用于單個(gè)細(xì)胞中的DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組分析；單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序技術(shù)（scNOMeRe-seq）用于從同一個(gè)單細(xì)胞中同時(shí)進(jìn)行染色質(zhì)可及性、DNA甲基化和RNA表達(dá)的全基因組分析。與哺乳動(dòng)物中這些技術(shù)的快速發(fā)展相比，植物中單細(xì)胞DNA甲基化的分析進(jìn)展要慢得多。雖然植物中的大多數(shù)單細(xì)胞研究都集中在轉(zhuǎn)錄組上，但有研究使用亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的隨機(jī)整合片段測(cè)序（BRIF-seq）揭示了玉米中4個(gè)四分體的16個(gè)微孢子的單細(xì)胞DNA甲基化組。WGBS結(jié)合熒光激活細(xì)胞分選，已經(jīng)允許揭示特定細(xì)胞類(lèi)型的DNA甲基化組，包括6種不同的根分生組織細(xì)胞群、精子和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、莖和非莖的芽分生組織細(xì)胞。這些研究揭示了植物細(xì)胞的異質(zhì)性和不同細(xì)胞類(lèi)型中DNA甲基化的動(dòng)態(tài)變化。
DNA甲基化可塑性
擬南芥品系Col-0的DNA甲基化變化
在個(gè)體水平上，DNA甲基化動(dòng)態(tài)變化，并且可以在來(lái)自同一祖先的植物代際間變化，也可以在不同實(shí)驗(yàn)室中同一植物的不同組織以及來(lái)自相同組織的細(xì)胞之間變化。不同實(shí)驗(yàn)室中Col-0基因組DNA甲基化水平差異在CG中高達(dá)10%、在非CG甲基化區(qū)域達(dá)到7%。DNA甲基化模式表現(xiàn)出與上下文（CG、CHG、CHH）背景差異，在發(fā)育的各個(gè)階段觀察到CG甲基化穩(wěn)定、CHG甲基化增加、CHH甲基化減少。且與發(fā)育相關(guān)的大多數(shù)甲基化變化發(fā)生在著絲粒轉(zhuǎn)座元件（TEs）中。
圖 2. DNA甲基化可塑性及其對(duì)植物適應(yīng)環(huán)境中的作用。
B. 通過(guò)比較4種組織的DNA甲基化數(shù)據(jù)鑒定的CG DMCs分布。
C. 來(lái)自9種根細(xì)胞類(lèi)型的100 kb窗口中CG、CHG和CHH甲基化水平的主成分分析(PCA)。RT，根尖；EP，表皮；CO，皮層；EN，內(nèi)皮層；ST，髓；CRC，柱狀根帽；LC，下柱狀。
D. DNA甲基化對(duì)植物對(duì)免疫啟動(dòng)的敏感性。
E. IAA27的DNA甲基化變化與CLSY1的基因突變相結(jié)合，影響側(cè)根發(fā)育并賦予其對(duì)低鉀環(huán)境的適應(yīng)。"T"形實(shí)線表示DNA甲基化增加抑制IAA27表達(dá)。"T"形虛線表示IAA27表達(dá)負(fù)調(diào)控側(cè)根發(fā)育，較粗線條表示更高表達(dá)抑制作用更強(qiáng)。
F. 在暴露于UVB后，UVR8-DRM2模塊誘導(dǎo)的DNA甲基化減少激活了下游基因/TEs。虛線框表示UVR8和DRM2之間的物理作用位點(diǎn)。"T"形實(shí)線表示抑制了DRM2介導(dǎo)的DNA甲基化，較粗線條具有更強(qiáng)抑制作用。
相比之下，組織（如根和莖）之間的甲基化模式差異呈動(dòng)態(tài)變化，其中在常染色質(zhì)區(qū)域的CG甲基化和著絲粒區(qū)域的非CG甲基化變化具有顯著差異。這種表觀基因組的可塑性主要?dú)w因于自發(fā)的表觀遺傳變化。與基因突變相比，表觀遺傳變化的發(fā)生率高得多，且在擬南芥基因組中已經(jīng)鑒定出表觀遺傳突變熱點(diǎn)區(qū)域。盡管這些區(qū)域只占基因組中CG位點(diǎn)的約12%，但在這些熱點(diǎn)區(qū)域觀察到約63%的表觀遺傳突變事件。甲基化模式差異的另一個(gè)重要因子是甲基化機(jī)制的組織/細(xì)胞特異性表達(dá)。已知有十個(gè)基因參與表觀遺傳調(diào)控，包括DNA甲基化減少1（DDM1）、ARGONAUTE 9（AGO9）和SU(VAR)3-9同源物4（SUVH4），這些基因在干細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。CLASSY家族基因表現(xiàn)出組織特異性表達(dá)模式；這些蛋白以組織特異性方式調(diào)控24-nt siRNA產(chǎn)生和DNA甲基化�；钚訢NA去甲基化是組織間差異性甲基化的另一因素，擬南芥DNA去甲基化由4個(gè)DEMETER家族成員—DME、DML2、DML3和ROS1調(diào)控，野生型中鑒定出的許多組織特異性甲基化變化在這4個(gè)基因的四重突變體中都不存在。
響應(yīng)環(huán)境的DNA甲基化變化
越來(lái)越多的研究表明，DNA甲基化作為一種可遺傳的胞嘧啶修飾，能夠響應(yīng)并適應(yīng)各種生物和非生物脅迫。本文重點(diǎn)描述DNA甲基化在植物適應(yīng)生物和非生物脅迫中重要作用的最新研究。
雖然基因突變賦予了植物長(zhǎng)期適應(yīng)性，但DNA甲基化可以快速響應(yīng)環(huán)境挑戰(zhàn)并迅速提高適應(yīng)度。Sheikh等人（2023年）發(fā)現(xiàn)了接頭組蛋白H1和DNA甲基化在植物防御中的重要作用。由于植物防御基因表達(dá)變化，一個(gè)含有3種組蛋白H1變體（h1.1、h1.2、h1.3）的擬南芥三重突變體表現(xiàn)出對(duì)植物病原體感染抗性增強(qiáng)。在病原體感染之前使用22-氨基酸鞭毛蛋白（flg22）進(jìn)行預(yù)處理的啟動(dòng)過(guò)程增強(qiáng)了野生型植物對(duì)隨后病原體感染抗性。然而h1突變體對(duì)啟動(dòng)不敏感。flg22處理導(dǎo)致h1防御基因啟動(dòng)子中的DNA甲基化增加，從而導(dǎo)致其抑制。這項(xiàng)研究表明，DNA甲基化可以快速響應(yīng)病原體感染，并通過(guò)調(diào)控防御基因表達(dá)影響植物防御。
DNA甲基化也可以在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中增強(qiáng)植物的適應(yīng)性，無(wú)論是依賴(lài)或獨(dú)立于基因突變。Shahzad等人（2020年）最近研究表明，DNA甲基化變化與基因突變相結(jié)合，允許植物響應(yīng)鉀缺乏。對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的感知和反應(yīng)對(duì)植物至關(guān)重要，必需營(yíng)養(yǎng)素鉀的缺乏可能導(dǎo)致根系發(fā)育不良。不同的擬南芥品系已經(jīng)進(jìn)化出2種策略，通過(guò)增加主根或側(cè)根的生長(zhǎng)來(lái)克服低鉀脅迫。Shahzad等人（2020年）使用全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）鑒定出CLSY1作為低鉀條件下側(cè)根發(fā)育的調(diào)控因子。低鉀抑制了吲哚-3-乙酸誘導(dǎo)27（IAA27）的降解，IAA27通過(guò)生長(zhǎng)素信號(hào)通路負(fù)向調(diào)控根分枝。同時(shí)CLSY1可以通過(guò)DNA甲基化沉默IAA27。在CLSY1的538位點(diǎn)上，天冬氨酸到谷氨酸變化與自然擬南芥品系中低鉀條件下側(cè)根發(fā)育顯著相關(guān)。攜帶編碼天冬氨酸的CLSY1等位基因品系在IAA27啟動(dòng)子上的DNA甲基化水平顯著增加，與攜帶編碼谷氨酸的等位基因品系相比，IAA27表達(dá)水平顯著下調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)表明，DNA甲基化可以協(xié)調(diào)遺傳變化，并促進(jìn)側(cè)根發(fā)育，使植物能夠克服具有挑戰(zhàn)性的環(huán)境。
盡管DNA甲基化已被認(rèn)為與植物適應(yīng)有關(guān)，但證據(jù)大多來(lái)自顯示DNA甲基化變化與環(huán)境變化相關(guān)的研究。Jiang等人（2021年）提供了直接證據(jù)來(lái)說(shuō)明紫外線照射如何抑制DNA甲基化。擬南芥中的DNA甲基化通過(guò)UVB光響應(yīng)，主要通過(guò)UV RESISTANCE LOCUS 8（UVR8，一種UVB光受體）和DRM2（一種新的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶）之間的物理互作實(shí)現(xiàn)。UVB照射通過(guò)UVR8依賴(lài)性通路誘導(dǎo)全基因組DNA低甲基化并解除轉(zhuǎn)座元件（TEs）抑制。這種UVR8-DRM2介導(dǎo)的TEs重新激活機(jī)制可能直接或間接調(diào)控參與植物抵御紫外線照射的關(guān)鍵基因表達(dá)。
自然群體中DNA甲基化變化的遺傳基礎(chǔ)
對(duì)特定基因組位點(diǎn)以及不同擬南芥品系的全基因組甲基化組的研究顯示，自然品系間的DNA甲基化存在顯著差異。與在個(gè)別品系中已充分描述的DNA甲基化建立和維持的調(diào)控因子相比，自然品系間DNA甲基化變化的遺傳和分子機(jī)制了解甚少。GWAS已經(jīng)鑒定出此過(guò)程的多個(gè)影響因子，其中CMT2因全基因組非CG甲基化水平、差異甲基化區(qū)域（DMRs）和CMT2靶向的轉(zhuǎn)座元件（TEs）被多個(gè)GWAS定位。這與CMT2作為負(fù)責(zé)維持CHH甲基化的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶功能以及CHH和CHG甲基化之間的強(qiáng)相關(guān)性相吻合。另一個(gè)TEs上CHH甲基化的主要決定因子是NRPE1，它編碼RNA聚合酶V的最大亞基，是RNA介導(dǎo)DNA甲基化（RdDM）通路的關(guān)鍵組分。NRPE1在調(diào)控TEs移動(dòng)性方面的作用也通過(guò)GWAS揭示。
在一項(xiàng)GWAS中，miR823A通常與CHG DMRs相關(guān)。將CHH甲基化作為協(xié)變量后，另一項(xiàng)RdDM/CMT2靶向TEs的CHG甲基化的GWAS鑒定出CMT3和miR823A。CMT3編碼負(fù)責(zé)維持CHG甲基化的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，而miR823A編碼的microRNA823A預(yù)計(jì)靶向CMT3。這些發(fā)現(xiàn)表明miR823A-CMT3模塊介導(dǎo)的CHG甲基化調(diào)控可能，但還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。
包括AGO9和AGO1在內(nèi)的ARGONAUTE基因被鑒定為自然群體中RdDM靶向TEs的CHH甲基化調(diào)控因子。這些基因在這些品系中的功能可能與Col-0中AGO9功能不同，因?yàn)閍go9突變體在RdDM靶向的低甲基化區(qū)域（hypo-DMR）的甲基化沒(méi)有變化。這表明在Col-0中沒(méi)有參與RdDM通路的AGO蛋白可能在其他品系中參與DNA甲基化。
MULTICOPY SUPPRESSOR OF IRA1（MSI1）編碼Polycomb抑制復(fù)合體2（PRC2）的一個(gè)亞基，該亞基催化組蛋白3賴(lài)氨酸27位點(diǎn)的三甲基化（H3K27me3）。在兩項(xiàng)最近的GWAS中，MSI1與44個(gè)DMR區(qū)域的CHG甲基化以及RdDM和CMT2靶向的TEs相關(guān)。在Col-0背景下，H3K27me3與DNA甲基化無(wú)關(guān)，與CMT3對(duì)CHG甲基化所必需的H3K9me2不同。這些發(fā)現(xiàn)表明在其他品系中DNA甲基化和H3K27me3之間可能存在相關(guān)性，這有待進(jìn)一步表征。
盡管沒(méi)有被重復(fù)鑒定，JUMONJI26（JMJ26）—BONSAI METHYLATION 1（IBM1）的同源物基因突變被報(bào)告與使用CHH作為協(xié)變量的條件GWAS中RdDM靶向TEs的CHG甲基化相關(guān)聯(lián)。敲除JMJ26導(dǎo)致RdDM靶向TEs的CHG甲基化增加。鑒定JMJ26的關(guān)鍵是在CHG甲基化的GWAS時(shí)將CHH甲基化作為協(xié)變量的條件分析。這一發(fā)現(xiàn)突出了GWAS在群體表觀遺傳學(xué)研究中的創(chuàng)新潛力，包括研究方法或群體構(gòu)建。
除了轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子外，大量的基因突變，無(wú)論是鄰近還是遠(yuǎn)端，已被證明與靶位點(diǎn)的DNA甲基化變化相關(guān)聯(lián)。盡管如此，關(guān)于這些關(guān)聯(lián)背后的因果基因突變知之甚少，因?yàn)檫�沒(méi)有驗(yàn)證這些關(guān)聯(lián)背后的遺傳變化。一些研究表明，諸如TE插入和結(jié)構(gòu)變異（SVs）的基因突變可以影響附近位點(diǎn)的DNA甲基化。Ahmed等人（2011年）發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有匹配24-nt siRNA的數(shù)百個(gè)TEs通過(guò)鄰近密集甲基化的TEs甲基化擴(kuò)散獲得DNA甲基化。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在211個(gè)擬南芥品系中，近一半的新TE插入位點(diǎn)在帶有TE插入的品系中高度甲基化并擴(kuò)散到鄰近區(qū)域。直接證據(jù)來(lái)自CEN180重復(fù)序列在常染色質(zhì)靶位點(diǎn)的從頭沉積，從而在ibm1突變體中誘導(dǎo)局部DNA甲基化的建立和擴(kuò)散。在擬南芥1001個(gè)甲基化組中，大部分SVs（22%至50%）的甲基化存在差異，表明了SV對(duì)鄰近序列DNA甲基化的影響。SV如何影響DNA甲基化的最好例子是擬南芥中的PHOSPHORIBOSYLANTHRANILATE ISOMERASE（PAI）基因家族（PAI1至PAI4），一些品系包含未甲基化的PAI基因，如Col，而其他品系包含甲基化的PAI基因，如WS。Col包含3個(gè)不連鎖的PAI基因（PAI1、PAI2和PAI3），而WS包含4個(gè)PAI基因，具有PAI1至PAI4的倒置重復(fù)。這個(gè)倒置重復(fù)導(dǎo)致所有4個(gè)PAI基因甲基化。
易小結(jié)
最近的全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWASs)為理解轉(zhuǎn)座元件(TEs)非CG甲基化的自然變異的遺傳基礎(chǔ)提供了重要信息。然而目前對(duì)CG甲基化的遺傳基礎(chǔ)以及其他基因組特征（如啟動(dòng)子區(qū)域和蛋白質(zhì)編碼基因）的DNA甲基化了解仍然知之甚少。高通量檢測(cè)和驗(yàn)證表觀遺傳變化的功能，以及將這些變化在作物育種項(xiàng)目中的應(yīng)用，是未來(lái)重要的研究工作。在群體水平上的包含多組學(xué)數(shù)據(jù)集的全基因組染色質(zhì)圖譜的可用性，無(wú)疑將加深對(duì)表觀遺傳變化的理解。結(jié)合大數(shù)據(jù)分析與表觀遺傳編輯技術(shù)，用于挖掘和應(yīng)用表觀遺傳變化，將極大增強(qiáng)作物育種項(xiàng)目。
未解決的問(wèn)題
- 表觀遺傳變化在植物抗性方面的作用有多大？
- 如何高通量檢測(cè)和驗(yàn)證表觀遺傳變化功能？
- 如何有效地將表觀遺傳變化應(yīng)用于作物育種項(xiàng)目？
Liu J, Zhong X. Population epigenetics: DNA methylation in the plant omics era. Plant Physiol. 2024 Feb 16. pii: 7609601. doi: 10.1093/plphys/kiae089. PubMed PMID: 38366882.
- 空間和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)綜合分析揭示與不良預(yù)后相關(guān)的中間癌細(xì)胞群
- 單細(xì)胞測(cè)序助力揭示右心室容量超荷會(huì)通過(guò)免疫反應(yīng)重啟心肌細(xì)胞的增殖
- BS+ChIP-seq在揭示DNA甲基化調(diào)控非編碼RNA抑制腫瘤侵襲性中的應(yīng)用
- 靶基因甲基化測(cè)序(Target-BS)等在揭示特應(yīng)性皮炎新發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用
- ChIP等揭示糖皮質(zhì)激素和TET2共調(diào)控促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移的表觀遺傳機(jī)制
- 游離細(xì)胞DNA（cfDNA）檢測(cè)整體研究方案及其應(yīng)用案例
- DNA甲基化修飾整體研究方案技術(shù)介紹及經(jīng)典案例分析
- DNA甲基化詳解
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