本文要點(diǎn)：在近紅外二區(qū)（NIR-II，1000-3000 nm）發(fā)射的熒光染料為血管和淋巴系統(tǒng)的實(shí)時(shí)和高分辨率成像提供了重大進(jìn)展。然而，在體內(nèi)NIR-II追蹤標(biāo)記細(xì)胞的課題仍然具有挑戰(zhàn)性。在這里，我們開(kāi)發(fā)了一種屏蔽單元-供體-受體-供體-屏蔽單元（S-D-A-D-S）NIR-II熒光團(tuán)（FE-4ZW），帶有兩性離子末端基團(tuán)，用于高效細(xì)胞標(biāo)記，而無(wú)需使用細(xì)胞穿透肽，從而增強(qiáng)了細(xì)胞遷移位置的非侵入性體內(nèi)測(cè)定。拴系末端磺基銨內(nèi)鹽具有對(duì)細(xì)胞膜的高親和力，因此即使對(duì)于固定細(xì)胞也能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的標(biāo)記。移植干細(xì)胞的命運(yùn)和腫瘤細(xì)胞在腦或外周組織中沿淋巴系統(tǒng)的遷移由細(xì)胞內(nèi)化的FE-4ZW清楚地監(jiān)測(cè)。本文還證實(shí)，臨床使用的表面活性劑D-α-生育酚聚乙二醇-1000琥珀酸酯可以減少肝臟和脾臟對(duì)FE-4ZW的攝取。本文報(bào)道的熒光團(tuán)設(shè)計(jì)策略和細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)為細(xì)胞遷移的可視化和對(duì)重新定位過(guò)程的洞察開(kāi)辟了一個(gè)新的領(lǐng)域，從而最終為更詳細(xì)地研究干細(xì)胞治療和腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制提供了機(jī)會(huì)。

 

 

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方案1. FE-4ZW作為細(xì)胞示蹤劑的制造和體內(nèi)跟蹤血液循環(huán)和淋巴系統(tǒng)中細(xì)胞遷移的圖示

 

本文利用具有 S-D-A-D-S 骨架的成熟小分子核心結(jié)構(gòu)來(lái)開(kāi)發(fā) NIR-II 熒光團(tuán)，該熒光團(tuán)可以很容易地與細(xì)胞壁和隔室的脂質(zhì)單層/雙層相互作用。同時(shí)，系統(tǒng)地篩選了不同的末端組（兩性離子和非兩性離子），這些末端組被拴在NIR-II熒光核心的外圍屏蔽單元上（方案1A）。最終，這種篩選方法能夠開(kāi)發(fā)出具有兩性離子基團(tuán)的可滲透NIR-II熒光團(tuán)（FE-4ZW），從而提供高效的體內(nèi)細(xì)胞跟蹤（方案1B）。更具體地說(shuō)，其兩性離子磺基團(tuán)的合理分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)為我們提供了用于細(xì)胞動(dòng)力學(xué)研究的理想細(xì)胞跟蹤探針。標(biāo)記細(xì)胞（神經(jīng)干細(xì)胞 [NSC] 和腫瘤細(xì)胞）的遷移和生物分布在 NIR-II 成像窗口中以非侵入性方式可視化，這賦予了高時(shí)間和空間分辨率。重要的是，跟蹤器幫助我們實(shí)現(xiàn)了腦腫瘤細(xì)胞通過(guò)淋巴系統(tǒng)和MLV轉(zhuǎn)移到頸部淋巴結(jié)的實(shí)時(shí)成像。觀(guān)察到FE-4ZW內(nèi)化的主動(dòng)和被動(dòng)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。展示的FE-4ZW NIR-II染料為獲得基于小有機(jī)NIR-II熒光團(tuán)的天然滲透性細(xì)胞造影劑提供了方便的合成方向，并為研究人員提供了非侵入性監(jiān)測(cè)標(biāo)記細(xì)胞的命運(yùn)和更好地了解細(xì)胞水平疾病進(jìn)展的潛在機(jī)會(huì)。

本文研究了FE-4ZW和FE-2PEG在單獨(dú)靜脈給藥后的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)。與循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)且具有部分腎排泄特征的FE-2PEG相比，F(xiàn)E-4ZW在短血循環(huán)時(shí)間（∼50分鐘）內(nèi)在肝臟和脾臟中積累更快。隨后，肝臟和脾臟中的熒光信號(hào)強(qiáng)度隨著時(shí)間的推移而增加，逐漸降低（圖1A-C和S13）�；�于FE-4ZW與FE-2PEG相比更快的肝臟攝取特征，我們假設(shè)當(dāng)FE-4ZW注射到小鼠的血液循環(huán)系統(tǒng)中時(shí)，它們也被肝細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞（Kupffer細(xì)胞）內(nèi)吞。這種發(fā)現(xiàn)的差異初步表明，與FE-2PEG相比，F(xiàn)E-4ZW具有更快的積累速率，從而表明FE-4ZW可能與細(xì)胞膜具有更強(qiáng)的相互作用，因此有可能作為更好的細(xì)胞造影劑。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了廣泛的體外和/或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)量FE-4ZW作為細(xì)胞造影劑的能力。

圖1. FE熒光團(tuán)提供有效的第二近紅外（NIR-II）熒光成像對(duì)比度水平的能力

 

由于FE-4ZW與細(xì)胞膜之間存在潛在的相互作用和/或親和力，我們的方案不要求使用CPP，因此在獲得熒光細(xì)胞方面更加簡(jiǎn)化和直接（圖1D-F）。利用幾種類(lèi)型的細(xì)胞系，包括肝臟、巨噬細(xì)胞、干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞來(lái)評(píng)估 FE 熒光團(tuán)系列。在FE-4ZW與不同細(xì)胞系共孵育的整個(gè)過(guò)程中，F(xiàn)E-4ZW標(biāo)記細(xì)胞的NIR-II熒光強(qiáng)度隨時(shí)間增加，其中在12小時(shí)時(shí)間點(diǎn)有足夠的標(biāo)記密度允許明亮的NIR-II成像（圖1F和S5）。對(duì)于所有測(cè)試的細(xì)胞系，F(xiàn)E-4ZW的明亮NIR-II熒光信號(hào)允許在內(nèi)化時(shí)明確地勾勒出細(xì)胞形狀（圖1E，F(xiàn)和S5）。

圖2. FE-4ZW作為一種高性能細(xì)胞標(biāo)記染料

 

相比之下，在 L-O2 細(xì)胞組中，當(dāng)它們與 FE-2PEG 或 FE-2PEG2ZW 熒光團(tuán)一起孵育時(shí)，獲得了非常低的熒光強(qiáng)度。這些結(jié)果表明，分子結(jié)構(gòu)在作為高效細(xì)胞標(biāo)記生物技術(shù)的作用中起著重要作用（圖2A，B）。FE-4ZW的細(xì)胞內(nèi)光穩(wěn)定性也是通過(guò)將標(biāo)記的L-O2細(xì)胞置于連續(xù)激光照射下來(lái)確定的（圖2C）。熒光信號(hào)僅在2小時(shí)的時(shí)間過(guò)程中以極慢的速率衰減。總的來(lái)說(shuō)，F(xiàn)E-4ZW是一種理想的細(xì)胞成像劑，具有明亮的細(xì)胞內(nèi)NIR-II熒光發(fā)射和優(yōu)異的光穩(wěn)定性。FE-4ZW的這種優(yōu)越性能為非侵入性跟蹤體內(nèi)細(xì)胞命運(yùn)奠定了基礎(chǔ)。

在細(xì)胞中使用FE-4ZW孵育12小時(shí)后，用新鮮培養(yǎng)基替換含有未內(nèi)化FE-4ZW的細(xì)胞培養(yǎng)基。將標(biāo)記的細(xì)胞順序培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá) 7 天，每天收集上清液并通過(guò) NIR-II 檢測(cè)器成像。所有收集的上清液均未觀(guān)察到可檢測(cè)到的 NIR-II 信號(hào)，而細(xì)胞本身表現(xiàn)出明亮的 NIR-II 熒光信號(hào)，這表明標(biāo)記細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi) FE-4ZW 染料的穩(wěn)定內(nèi)化（圖 2E、F）。另一個(gè)補(bǔ)充需求是體內(nèi)細(xì)胞追蹤，即使在主要標(biāo)記信號(hào)顯示細(xì)胞增殖過(guò)程中耗盡后，也能充分檢測(cè)增殖的細(xì)胞。即使細(xì)胞計(jì)數(shù)呈指數(shù)增長(zhǎng)（經(jīng)CCK8測(cè)定證實(shí)），穩(wěn)定的NIR-II熒光信號(hào)仍可檢測(cè)到長(zhǎng)達(dá)6天（圖2G-I）。上述結(jié)果表明，F(xiàn)E-4ZW在細(xì)胞中的標(biāo)記和/或內(nèi)化可以維持很長(zhǎng)時(shí)間，從而為利用高對(duì)比度NIR-II熒光生物成像在細(xì)胞水平上監(jiān)測(cè)復(fù)雜的生理過(guò)程提供了機(jī)會(huì)。

圖3. 通過(guò)使用 FE-4ZW 進(jìn)行第二次近紅外 （NIR-II） 熒光成像來(lái)跟蹤移植神經(jīng)干細(xì)胞 （NSC） 的位置

 

通過(guò)用 FE-4ZW 預(yù)培養(yǎng) NSC 來(lái)證明活體 NSC 跟蹤，然后靜脈注射標(biāo)記的 NSC。根據(jù)既定方案，通過(guò)離心仔細(xì)收集FE-4ZW標(biāo)記的發(fā)光NSC，隨后靜脈內(nèi)移植到Balb / C小鼠模型的血液循環(huán)系統(tǒng)中（圖3A）。NIR-II熒光信號(hào)在立即觀(guān)察時(shí)提供了清晰的肺部輪廓，從而揭示了標(biāo)記的NSC首先在肺部積聚。這一結(jié)果與之前關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞監(jiān)測(cè)的報(bào)道一致。肺內(nèi)FE-4ZW標(biāo)記的NSC的NIR-II熒光信號(hào)隨著時(shí)間的推移逐漸減少，并在72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)后幾乎消失。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，肝臟中的NIR-II熒光信號(hào)逐漸增加。這些結(jié)果證實(shí)，靜脈注射后移植的NSC在肺部初始積累后逐漸轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟（圖3B-E）。通過(guò)跟蹤NSCs進(jìn)行縱向無(wú)創(chuàng)實(shí)時(shí)體內(nèi)成像，可為臨床NSC治療的生理機(jī)制和障礙的檢測(cè)提供便捷的細(xì)胞跟蹤技術(shù)。

監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的命運(yùn)對(duì)于研究潛在的腫瘤轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，但目前的非侵入性策略未能實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。皮內(nèi)注射FE-4ZW標(biāo)記的4T1腫瘤細(xì)胞，并觀(guān)察到腫瘤細(xì)胞（或細(xì)胞聚集簇）隨著時(shí)間的推移沿著淋巴管遷移（圖3F），從而最終接種在相鄰的淋巴結(jié)中（圖3G，H）。通過(guò)體外泄漏實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)試FE-4ZW的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性。結(jié)果表明，在細(xì)胞內(nèi)化后，F(xiàn)E-4ZW可以穩(wěn)定地存在于細(xì)胞區(qū)室中（圖2D-I）。此外，體內(nèi)NSC細(xì)胞追蹤結(jié)果顯示，F(xiàn)E-4ZW標(biāo)記的NSCs在肺內(nèi)停留了很長(zhǎng)時(shí)間，并逐漸循環(huán)到肝臟。這表明內(nèi)部化的FE-4ZW沒(méi)有與NSC分離。如果FE-4ZW從細(xì)胞中分離出來(lái)，肺的輪廓將迅速消失（圖3B，D）。圖3F中沿淋巴管自由移動(dòng)的熒光點(diǎn)的存在表明細(xì)胞聚集簇沿著淋巴管運(yùn)輸，而不是FE-4ZW染料自由移動(dòng)。本文報(bào)道的方法可能適用于監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞的命運(yùn)和遷移途徑，從而可以識(shí)別腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵參數(shù)。

圖4. FE-4ZW可用于淋巴通路的體內(nèi)成像和跟蹤腦腫瘤細(xì)胞循環(huán)

 

為證明 FE-4ZW 作為造影劑在體內(nèi)跟蹤 CSF 循環(huán)和跟蹤 MLV 和頸部淋巴結(jié)中細(xì)胞遷移的潛力。圖4A說(shuō)明了證明FE-4ZW作為腦脊液追蹤器潛力的實(shí)驗(yàn)過(guò)程。Cisterna Magna （CM） 的曝光過(guò)程、FE-4ZW 的CM 注射和獲取 NIR-II 圖像的過(guò)程均在 ISO 麻醉下進(jìn)行。圖4B顯示了FE-4ZW在腦背側(cè)分布的代表性時(shí)程圖像，表明FE-4ZW可以通過(guò)完整的頭皮進(jìn)行CM輸送來(lái)對(duì)腦脊液循環(huán)通路進(jìn)行成像。之后，我們收集了腦組織，并對(duì)FE-4ZW在腦組織表面以不同姿勢(shì)的分布進(jìn)行了成像。圖4C顯示CM注射的FE-4ZW沿PVS分布和大腦中動(dòng)脈周?chē)�的PVS輪廓被清晰地照亮（圖4D）。在證明FE-4ZW 作為所需的 CSF 示蹤劑后，我們通過(guò) CM 注射 FE-4ZW 標(biāo)記的 GL261 細(xì)胞對(duì)腦腫瘤細(xì)胞遷移進(jìn)行了體內(nèi)監(jiān)測(cè)（圖 5E）。注射FE-4ZW標(biāo)記的GL261細(xì)胞后，我們監(jiān)測(cè)了GL261腦腫瘤細(xì)胞的行進(jìn)途徑。對(duì)明確的MLV結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像，表明CM注射的細(xì)胞沿著MLV隨腦脊液循環(huán)而行進(jìn)（圖4F）。消失的MLV結(jié)構(gòu)意味著注射的細(xì)胞具有時(shí)間依賴(lài)性遷移過(guò)程（圖4F，G）。在細(xì)胞循環(huán) 2 小時(shí)后收集 MLV，并通過(guò)內(nèi)部 NIR-II 熒光顯微鏡對(duì) MLV 內(nèi)細(xì)胞的分布進(jìn)行成像。代表性圖像顯示，注射的細(xì)胞主要分布在覆蓋橫竇和嗅球的MLV內(nèi)（圖4H，I）。然后，我們?nèi)コ龑m頸皮膚，并在成像裝置下暴露CLNs，在允許細(xì)胞循環(huán)2小時(shí)后，周?chē)�的熒光信�?hào)表明CLN（sCLNs和dCLNs）可能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病（如腦腫瘤）具有重要功能（圖4J）。使用NIR-II熒光顯微鏡來(lái)觀(guān)察注射細(xì)胞在sCLNs和dCLNs中的詳細(xì)分布。被明亮熒光點(diǎn)覆蓋的 sCLN 和 dCLN 意味著GL261 細(xì)胞簇已遷移到 sCLN 和 dCLN 中（圖4K）。FE-4ZW標(biāo)記組的熒光面積大于PBS組，進(jìn)一步證實(shí)了sCLNs和dCLNs充滿(mǎn)了標(biāo)記的GL261細(xì)胞（圖4L）。體外細(xì)胞成像和體內(nèi)細(xì)胞跟蹤研究的結(jié)果證實(shí)，F(xiàn)E-4ZW可以作為細(xì)胞造影劑。FE-4ZW的優(yōu)點(diǎn)包括：（1）充分保持光穩(wěn)定性，能夠滿(mǎn)足重復(fù)的成像要求;（2）高效的細(xì)胞標(biāo)記能力，無(wú)需使用CPP，如TAT，CPP的一種。

具有拴系兩性離子泡沫銨末端基團(tuán)的 NIR-II 熒光發(fā)射 S-D-A-D-S 熒光團(tuán)提供了一種無(wú)需 CPP 即可高效標(biāo)記活細(xì)胞的方法。引入的四性離子磺化銨末端基團(tuán)不僅賦予FE-4ZW優(yōu)異的水溶性，而且提高了與各類(lèi)細(xì)胞共孵育時(shí)與細(xì)胞膜的親和力。FE-4ZW用于體內(nèi)監(jiān)測(cè)移植細(xì)胞的命運(yùn)和腦腫瘤細(xì)胞遷移到頸部淋巴結(jié)的命運(yùn)。FE-4ZW染料在細(xì)胞中內(nèi)化并保留在細(xì)胞中，基于形態(tài)學(xué)沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性。此外，NIR-II熒光染料FE-4ZW可對(duì)標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)和可視化。此外，盡管NIR-II熒光信號(hào)強(qiáng)度隨著原代FE-4ZW標(biāo)記細(xì)胞的增殖而降低，但增殖6 d后的NIR-II熒光信號(hào)強(qiáng)度仍可檢測(cè)到。

干細(xì)胞療法可以通過(guò)減少炎癥和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)來(lái)修復(fù)目標(biāo)位置的受損細(xì)胞，因此評(píng)估施用的NSC的積累效率至關(guān)重要。得益于高NIR-II熒光信號(hào)強(qiáng)度和優(yōu)異的細(xì)胞內(nèi)化學(xué)/光穩(wěn)定性，使用FE-4ZW對(duì)NSCs的轉(zhuǎn)移和生物分布進(jìn)行了非侵入性追蹤。這是首次利用不含CPP的有機(jī)小分子NIR-II熒光發(fā)射熒光團(tuán)，以監(jiān)測(cè)小動(dòng)物模型中靜脈注射后干細(xì)胞的遷移過(guò)程。在腫瘤轉(zhuǎn)移中，癌細(xì)胞可以從原發(fā)腫瘤中逃逸，與血液和/或淋巴管一起遷移，并在遠(yuǎn)處器官/組織中播種新的腫瘤。本文量身定制的熒光團(tuán)還提供了一種潛在的方法，可以使用非侵入性途徑在體內(nèi)可視化此類(lèi)轉(zhuǎn)移過(guò)程的特定方面。

先前的報(bào)道表明，在花青NIR-I熒光發(fā)射熒光團(tuán)上修飾兩性離子基團(tuán)可以降低熒光團(tuán)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，從而賦予花青染料更快的腎臟排泄速度。NIR-II 發(fā)射熒光團(tuán) （FE-4ZW） 的兩性離子 S-D-A-D-S 結(jié)構(gòu)促進(jìn)了對(duì)細(xì)胞膜的高親和力和相互作用。所設(shè)計(jì)的兩性離子泡沫銨基團(tuán)是FE-4ZW高內(nèi)化能力的確定因素。FE-4ZW的標(biāo)記效率高于其他FE染料（FE-2PEG、FE-2PEG2ZW和FE-4SO3Na）。FE-4ZW的細(xì)胞攝取機(jī)制包括能量依賴(lài)性?xún)?nèi)吞作用和能量依賴(lài)性被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。通過(guò)培養(yǎng)溫度的降低和額外的內(nèi)吞抑制劑觀(guān)察到的明顯的熒光信號(hào)強(qiáng)度消耗表明，內(nèi)吞作用是FE-4ZW的少數(shù)潛在攝取途徑之一。另一種攝取機(jī)制可以用以下幾點(diǎn)來(lái)解釋?zhuān)海?）FE-2PEG未能內(nèi)化為固定細(xì)胞，甚至無(wú)法將工作濃度提高到50μM;（2）在低溫條件下或在抑制劑存在下進(jìn)行細(xì)胞攝取不能分別完全抑制FE-4ZW的攝取。此外，使用TPGS/FE-4ZW混合物后，F(xiàn)E-4ZW的肝臟和脾臟積累減少。FE-4ZW為提高體內(nèi)細(xì)胞追蹤的成像質(zhì)量提供了令人興奮的可能性。為了解決一些未滿(mǎn)足的實(shí)際需求，可以考慮以下改進(jìn)：（1）由于與波長(zhǎng)相關(guān)的穿透深度，將FE-4ZW的發(fā)射波長(zhǎng)擴(kuò)展到NIR-IIb可以進(jìn)一步提高成像質(zhì)量;（2）簡(jiǎn)化FE-4ZW的合成工藝，使其更適合臨床應(yīng)用�？傮w而言，NIR-II 熒光發(fā)射熒光團(tuán) FE-4ZW 為高分辨率非侵入性跟蹤移植細(xì)胞提供了一種便捷的策略，并為在 NIR-II窗口中生產(chǎn)發(fā)射熒光信號(hào)的高性能細(xì)胞成像劑提供了合理的設(shè)計(jì)策略。

 

參考文獻(xiàn)

Sun B, Ma R, Wang X, et al. A high‐performance cell‐labeling NIR‐II dye for in vivo cell tracking[J]. View, 2024, 5(2): 20230097.

 

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