小鼠實(shí)驗(yàn)中PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR技術(shù)的介紹與應(yīng)用
MBTI測(cè)試將人的性格分為了16型，主要包括四大類：分析型、穩(wěn)健型、和諧型、自由型，有的人可能適合投身科研領(lǐng)域成為偉大的科學(xué)家，而有的人可能邏輯性強(qiáng)，責(zé)任心重具備成為leader的潛質(zhì)，再有的人可能感情細(xì)膩，富有同情心投身醫(yī)療、教育事業(yè)……無(wú)論你是哪種人，看完今天的知識(shí)點(diǎn)，保證你會(huì)是一名合格的“P人”。
看到這里的小伙伴都會(huì)有疑問(wèn)了
什么是“P人呢”？
P就是在我們?nèi)粘?shí)驗(yàn)，尤其是小鼠實(shí)驗(yàn)中的各種PCR包括：PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR等。下面我就一一為大家講解。
PCR
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。由1983年美國(guó)Mullis首先提出設(shè)想，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)，即簡(jiǎn)易DNA擴(kuò)增法，意味著PCR技術(shù)的真正誕生。到如今2013年，PCR已發(fā)展到第三代技術(shù)。1976年，中國(guó)科學(xué)家錢嘉韻，發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術(shù)發(fā)展也做出了基礎(chǔ)性貢獻(xiàn)。
DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過(guò)溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計(jì)引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。主要反應(yīng)步驟可以總結(jié)為：高溫變性，低溫退火，中溫延伸。
① 高溫變性：通過(guò)高溫（約95℃）加熱一定時(shí)間，將模板DNA解離成單鏈的形式，以便與引物結(jié)合；② 低溫退火（復(fù)性）：降溫至約55℃時(shí)，引物與模板DNA單鏈按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合；③ 中溫延伸：再將溫度調(diào)至約72℃（適合DNA聚合酶反應(yīng)的溫度），在Taq DNA聚合酶的作用下，DNA模板和引物結(jié)合物沿著磷酸到五碳糖（5'→3'）的方向，按照堿基配對(duì)和半保留復(fù)制原則合成一條新的、與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。通過(guò)經(jīng)歷變性、退火和延伸幾個(gè)循環(huán)后，待擴(kuò)增的基因可以被擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍（1）。
這類PCR在小鼠中主要用于基因敲除和敲入小鼠等轉(zhuǎn)基因生物的基因型鑒定（2）。
當(dāng)然在開(kāi)始PCR前DNA的抽提將決定整個(gè)實(shí)驗(yàn)的成敗，DNA的抽提方法及后續(xù)建議使用濃度可以參考我們之前的推文：
https://www.modelorg.com/portal/article/index/id/2382/post_type/1.html
在反應(yīng)過(guò)程中有的時(shí)候會(huì)發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)了非預(yù)期條帶，那么可能是您的反應(yīng)體系存在污染，這部分內(nèi)容之前我們也有詳細(xì)的介紹如何避免污染哦：https://www.modelorg.com/portal/article/index/id/2384/post_type/1.html
qPCR
實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過(guò)內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，通過(guò)熒光信號(hào)，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。
1 TaqMan探針?lè)ǎ?/strong>
探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。
2 SYBRGreenⅠ熒光染料法：
在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
SYBR定量PCR擴(kuò)增熒光曲線圖
PCR產(chǎn)物熔解曲線圖（單一峰圖表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的單一性）
數(shù)據(jù)分析
通過(guò)實(shí)時(shí)熒光收集到的信號(hào)，儀器會(huì)自動(dòng)繪制熒光曲線，通常5-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)都屬于背景信號(hào)，然后將其設(shè)置為擴(kuò)增曲線的背景或基線。在理想條件下，PCR產(chǎn)物量呈指數(shù)倍增長(zhǎng)Yn=Y0×2^n（X0：初始模板量，n：PCR循環(huán)次數(shù)，Yn：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量）。但實(shí)際上可能引物模板引物消耗完，DNA聚合酶逐漸失活等原因，產(chǎn)物量就恒定。熒光強(qiáng)度就呈“S型”曲線即“擴(kuò)增曲線（Amplication plot）”，分為基線期、指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期。再根據(jù)待測(cè)樣品的Ct，可計(jì)算樣品拷貝數(shù)/濃度。通常模板每稀釋10倍，CT值增大3.33。如果研究基因表達(dá)量通過(guò)比較達(dá)到設(shè)定熒光閾值所需的Ct值大小，可以比較出基因表達(dá)量的高低。
qPCR主要應(yīng)用：
2、基因拷貝數(shù)的檢測(cè)：能夠準(zhǔn)確的定量出相關(guān)基因在染色體中的拷貝數(shù)。
3、特殊RNA的轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)：根據(jù)特殊RNA的結(jié)構(gòu)，如microRNA、circRNA等，設(shè)計(jì)其特殊引物，如莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物、反向引物等，對(duì)這類RNA的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定性、定量分析。
RT—PCR
RT—PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程分為兩步，第一步是經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用，從RNA合成cDNA的過(guò)程；第二步是以cDNA為模板，在DNA聚合酶作用下擴(kuò)增目的片段的過(guò)程。
作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無(wú)論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無(wú)RNA酶和基因組DNA的污染。用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇隨機(jī)引物、Oligo dT及基因特異性引物中的一種。對(duì)于短的不具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA，3種都可（3）。
RT-PCR其操作方法分為兩種，即一步法和兩步法。一步法RT-PCR，逆轉(zhuǎn)錄同PCR擴(kuò)增結(jié)合在一起，即cDNA合成與PCR擴(kuò)增反應(yīng)在同一管Buffer及酶中進(jìn)行，一步完成。兩步法RT-PCR，RNA首先在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下生成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分成兩步進(jìn)行。
RT—PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平、細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
RT-qPCR
定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）是應(yīng)用于以RNA作為起始材料的PCR實(shí)驗(yàn)中的一種實(shí)驗(yàn)方法。在該方法中，總RNA或信使RNA（mRNA）首先通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（cDNA）。隨后，以cDNA為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。
RT-qPCR可通過(guò)一步法或兩步法來(lái)完成。一步法RT-qPCR把逆轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增結(jié)合在一起，使逆轉(zhuǎn)錄酶與DNA聚合酶在同一管內(nèi)同樣緩沖液條件下完成反應(yīng)。一步法RT-qPCR只需要利用序列特異性引物。在兩步法RT-qPCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增過(guò)程是在兩個(gè)管中完成，使用不同的優(yōu)化的緩沖液、反應(yīng)條件、以及引物設(shè)計(jì)策略。
RT-qPCR已被用于多種分子生物學(xué)的應(yīng)用中，其中包括基因表達(dá)分析、RNA干擾驗(yàn)證、微陣列驗(yàn)證、病原體檢測(cè)、基因測(cè)試和疾病研究（4）。
希望這篇“P文”能對(duì)您的實(shí)驗(yàn)有一定幫助，讓您成為一個(gè)合格的“P人”。最后，大家如果不想在PCR鑒定上浪費(fèi)時(shí)間，南模生物也可提供大小鼠基因型鑒定服務(wù)，更多詳情請(qǐng)聯(lián)系我們。
1.多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)研究和應(yīng)用．中國(guó)知網(wǎng)
2.Nobel Media AB (2014) The 2007 Nobel Prize in Physiology or Medicine - Advanced Information. nobelprize.org
3.胡奇林，林鋒強(qiáng)，陳少鶯等. 應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)番鴨呼腸孤病毒．《中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)》，2004
4.Bustin S. (ed) (2004) A-Z of Quantitative PCR.IUL Biotechnology Series, International University Line, La Jolla, California.
關(guān)于我們
上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，簡(jiǎn)稱"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科創(chuàng)板上市高科技生物公司（股票代碼：688265），始終以編輯基因、解碼生命為己任，專注于模式生物領(lǐng)域，打造了以基因修飾動(dòng)物模型研發(fā)為核心，涵蓋多物種模型構(gòu)建、飼養(yǎng)繁育、表型分析、藥物臨床前評(píng)價(jià)等多個(gè)技術(shù)平臺(tái)，致力于為全球高校、科研院所、制藥企業(yè)等客戶提供全方位、一體化的基因修飾動(dòng)物模型產(chǎn)品解決方案。
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