本文要點(diǎn)：骨肉瘤是一種致命的骨腫瘤，多發(fā)于兒童和青少年，具有局部破壞性和高轉(zhuǎn)移性。迫切需要針對(duì)骨肉瘤具有高治療效果和精確診斷的獨(dú)特納米平臺(tái)。多模態(tài)光學(xué)成像和程序化治療，包括協(xié)同光熱-化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療 (PTT-CDT) 引發(fā)免疫遺傳性細(xì)胞死亡 (ICD) 是一種有前途的策略，它具有高生物成像靈敏度，可準(zhǔn)確描繪骨肉瘤，治療效果顯著，副作用可忽略不計(jì)。

 

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方案1. 骨肉瘤靶向mCu&Ce@ICG/RGD的構(gòu)建過程示意圖，用于NIR-II熒光/MR生物成像和PTT-CDT-ICD協(xié)同腫瘤抑制

 

本文開發(fā)了一種簡(jiǎn)便的一步法合成具有介孔納米結(jié)構(gòu)的多功能 Cu&Ce 氧化物納米球 (mCu&Ce)。據(jù)報(bào)道，在 ICG 封裝和 RGD 肽表面接枝(mCu&Ce@ICG/RGD) 后，該納米平臺(tái)可準(zhǔn)確識(shí)別骨肉瘤并在腫瘤微環(huán)境 (pH = 6.5) 下觸發(fā) ICG、Cu 和 Ce 離子的劇烈釋放（方案1）。進(jìn)入骨肉瘤腫瘤細(xì)胞后，mCu&Ce@ICG/RGD 可在近紅外激光照射下有效產(chǎn)生高溫并進(jìn)而促進(jìn)•OH 的生成。PTT/CDT 協(xié)同腫瘤消融將在體外和體內(nèi)實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，熱量和擴(kuò)增的 ROS 都通過激發(fā) ICD 來激活有效的 T 細(xì)胞生成，從而產(chǎn)生全身抗骨肉瘤免疫反應(yīng)，從而顯著介導(dǎo)有效的腫瘤免疫治療。此外，基于Cu&Ce 的納米平臺(tái)可以通過 NIR-II 熒光和磁共振雙模生物成像對(duì)骨肉瘤進(jìn)行精確的早期診斷。總之，本研究設(shè)計(jì)了一種具有雙模生物成像特性的簡(jiǎn)便的 Cu&Ce 納米平臺(tái)。它可以特異性地識(shí)別骨肉瘤，并通過 PTT 增強(qiáng)的 CDT 實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞抑制，從而進(jìn)一步顯著誘導(dǎo) ICD 增強(qiáng)。

圖1. mCu&Ce@ICG/RGD 的表征

 

mCu&Ce@ICG/RGD納米平臺(tái)的制備具體流程如圖1所示。首先以氯化銅（CuCl 2）和氯化鈰（CeCl 3）為前驅(qū)體（重量比=7:3）在水相體系中首次制備出親水性的mCu&Ce納米粒子，在90°C下攪拌均勻后，加入烏洛托品不同時(shí)間后可得到一系列表面粗糙的合金化Cu&Ce納米球。進(jìn)一步臨床熒光團(tuán)ICG負(fù)載到中孔納米結(jié)構(gòu)中（mCe&Cu@ICG），負(fù)載效率約為12.5  %（w/w）。接下來，為了延長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間并進(jìn)行隨后的靶向修飾，將親水性PEG 2000 -NH 2包裹在mCe&Cu@ICG的界面上。最后，通過脫水縮合反應(yīng)將活性骨肉瘤識(shí)別配體RGD交聯(lián)在ICG負(fù)載的雙金屬納米粒子的外層（mCe&Cu@ICG/RGD）。令人興奮的是，表面接枝RGD后ζ電位明顯降低，這可歸因于-NH2基團(tuán)的消耗。在mCe&Cu@ICG/RGD中發(fā)現(xiàn)不明顯的形態(tài)轉(zhuǎn)變和尺寸變化（圖 1L）。同時(shí)，與ICG類似，ICG封裝納米平臺(tái)的發(fā)射光譜理想地延伸到NIR-II，并且上述兩個(gè)樣品的非峰值NIR-II發(fā)光圖像非常強(qiáng)，證明了mCe&Cu@ICG/RGD的成功設(shè)計(jì)（圖 1 P）

圖2. pH 敏感生物降解、ROS 生成和高溫測(cè)定

 

由于mCe&Cu@ICG/RGD是為了激活I(lǐng)CG的釋放而設(shè)計(jì)的，因此在細(xì)胞外弱酸誘發(fā)下，mCe&Cu基框架生物降解發(fā)生了類Fenton反應(yīng)。在pH=6.5條件處理下的生物降解效率在所有時(shí)間點(diǎn)都明顯高于pH=7.4組，6h時(shí)框架初步崩潰，納米顆粒釋放，36h時(shí)所有納米球消失，出現(xiàn)大量Cu&Ce基顆粒。這些納米顆粒能夠傳導(dǎo)腫瘤組織浸潤(rùn)。在腫瘤組織中細(xì)胞外弱酸性pH值浸泡36小時(shí)后，mCe&Cu@ICG/RGD的平均直徑從∼68nm急劇下降到 ∼5nm ， 進(jìn)一步表明結(jié)構(gòu)整體崩解。同時(shí)，在不同的孵育期內(nèi)還測(cè)定了pH=6.5生理緩沖液上清液中ICG的釋放曲線。我們觀察到ICG染料以時(shí)間依賴性方式逐漸釋放（圖2C）。同時(shí)，如pH=6.5條件下釋放的游離ICG的NIR-II發(fā)光圖像所示，熒光信號(hào)在36小時(shí)內(nèi)顯著增強(qiáng)，明顯強(qiáng)于pH=7.4組（圖 2D）。同時(shí)，在腫瘤微環(huán)境刺激緩沖液孵育不同時(shí)間后，Cu和Ce離子的釋放趨勢(shì)相似，孵育36h后約有90%的Cu/Ce離子被釋放。同時(shí)，在弱酸性環(huán)境下處理36h后，以商業(yè)•OH指示劑3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）評(píng)價(jià)Cu&Ce離子的類Fenton催化效果。在•OH催化下，產(chǎn)物氧化物TMB具有三個(gè)特征峰，顯然，與mCe&Cu@ICG/RGD + L基團(tuán)相比，mCu@ICG/RGD僅表現(xiàn)出邊際ROS生成率，正如預(yù)期的那樣，mCe&Cu@ICG/RGD + H2O2 + L 的•OH 增加量增加了 2 倍。納米平臺(tái)在高 H2O2條件下加上 808 nm 光照射時(shí)增強(qiáng)的化學(xué)動(dòng)力學(xué)能力（圖 2E）。隨后，由于 ICG 對(duì) 808 nm 激光的強(qiáng)吸收賦予 mCe&Cu@ICG/RGD 強(qiáng)大的光熱轉(zhuǎn)換性能。如圖 2F、G 所示，納米平臺(tái)的溫度呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間相關(guān)上升趨勢(shì)，在連續(xù) 300 秒的 808 nm 激光照射下溫度上升到最高水平（79.1 °C），證明了快速的近紅外光響應(yīng)。與此形成鮮明對(duì)比的是，在相同處理下，PBS 溶液中的溫度略有上升，在激光照射終點(diǎn)僅為 36.3 °C。此外，為了進(jìn)一步檢測(cè)激光-熱轉(zhuǎn)換效率（η），最近從冷卻-加熱循環(huán)計(jì)算了分散在水溶液中的mCe&Cu@ICG/RGD的熱量差異（圖 2H），具體的η值大約為∼55.92  %（圖2I）同時(shí)，在四次808nm激光開關(guān)循環(huán)后也監(jiān)測(cè)到出色的光熱穩(wěn)定性（圖 2J）。總體而言，所有結(jié)果證實(shí)了負(fù)載ICG的腫瘤響應(yīng)性程序化介孔Cu&Ce納米載體可進(jìn)一步應(yīng)用于通過PTT-CDT抑制惡性腫瘤。

圖3. PTT -CDT體外細(xì)胞殺傷及 ICD 指標(biāo)的表達(dá)

 

如圖 3A所示，用RGD修飾的納米平臺(tái)處理的ICG的紅光明顯強(qiáng)于mCe&Cu@ICG和游離ICG。如圖 3B 所示 ，與 mCu&Ce@ICG/RGD 組相比，mCu@ICG/RGD 組呈現(xiàn)出暗綠色熒光，這可以歸因于前者的生物降解率低。在 pH = 6.5 的緩沖液中孵育 36 小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)從 mCu 納米葉中釋放出的 Cu 離子相對(duì)較少，且含有大量 Cu 基碎片。值得注意的是，與本體溶液中的 ROS 生成趨勢(shì)一致，當(dāng)使用 808 nm 光照射并伴隨 H2O2預(yù)處理時(shí)，該趨勢(shì)會(huì)顯著加強(qiáng)（圖3G）。研究結(jié)果表明，更高的熱量產(chǎn)生可以顯著增強(qiáng)類 Fenton 反應(yīng)，因?yàn)?ROS 增強(qiáng)的結(jié)果凸顯了我們研究的重要性。

如圖 3D所示，與其他制劑相比，用 mCu&Ce@ICG/RGD + H2O2+ L處理的 143b 和 b 細(xì)胞 介導(dǎo)了最高水平的 CRT，這與細(xì)胞內(nèi) ROS 擴(kuò)增結(jié)果一致。此外，該組中還顯示出 HMGB1 信號(hào)減弱，CRT 水平的這種相反趨勢(shì)進(jìn)一步證明了我們的納米平臺(tái)增強(qiáng)的 ICD 效應(yīng)（圖 3D）。隨后，為了進(jìn)一步說明 ICD 相關(guān)蛋白的表達(dá)，通過蛋白質(zhì)印跡分析研究了各種處理后 143b 中的 CRT 和 HMGB1 水平。顯然，當(dāng)用 mCu&Ce@ICG/RGD + H2O2 + L 處理 143b 細(xì)胞時(shí)，CRT 在細(xì)胞膜上顯著上調(diào)，而 HMGB1 在細(xì)胞質(zhì)中顯著下調(diào) （圖 3E 、F）。與mCu&Ce@ICG/RGD 組相比，mCu&Ce@ICG/RGD + H2O2+ L中上述表達(dá)的蛋白質(zhì)水平分別大約高出 2 倍和降低 5 倍 （圖 3I、J），揭示了該處理強(qiáng)大的 ICD激發(fā)能力。最后，分別用CLSM和流式細(xì)胞儀獲得活死染色圖像和細(xì)胞凋亡-壞死研究。與細(xì)胞內(nèi)ROS生成和HMGB1的結(jié)果類似，143b細(xì)胞在mCu&Ce@ICG/RGD + H2O2+ L中經(jīng)歷最有效的細(xì)胞死亡 （圖 3K -N）。正如預(yù)期的那樣，當(dāng)mCu&Ce@ICG/RGD的濃度增加到300µg / mL時(shí)，H2O2預(yù)孵育加激光照射組中143b細(xì)胞的細(xì)胞活力僅為純納米平臺(tái)處理組的一半。這種最高的腫瘤細(xì)胞殺傷力主要由PTT同時(shí)擴(kuò)增的ROS和ICD介導(dǎo)。

圖4. 通過熒光成像、MRI 和光熱評(píng)估進(jìn)行體內(nèi)腫瘤靶向性評(píng)估

 

之后，研究mCu&Ce@ICG/RGD在骨肉瘤荷瘤裸鼠模型中的生物分布和腫瘤富集行為。首先，為了獲得準(zhǔn)確的腫瘤輪廓辨別，將mCu@ICG/RGD和mCu&Ce@ICG/RGD分別靜脈注射到荷瘤小鼠皮下，隨后在特定時(shí)間拍攝NIR-II熒光生物圖像，通過小動(dòng)物NIR-II熒光成像生物系統(tǒng)監(jiān)測(cè)該納米平臺(tái)在體內(nèi)的腫瘤靶向性和生物分布。顯然，在注射mCu&Ce@ICG/RGD后2 h，腫瘤輪廓逐漸清晰，熒光信號(hào)（超過1000 nm）最初集中在腫瘤部位，24 h時(shí)達(dá)最強(qiáng)，腫瘤輪廓與周圍外周肌肉組織明顯區(qū)分開來；隨后，它隨著時(shí)間的推移而緩慢衰減，殘留納米平臺(tái)保持在48小時(shí)（圖 4 A）。而mCu@ICG/RGD的熒光信號(hào)主要分散在肝臟中，并且在所有時(shí)間間隔內(nèi)都明顯高于mCu&Ce@ICG/RGD組�；�于在肝臟中的這種高積累，后一組的腫瘤組織幾乎無法區(qū)分（圖 4 A）。同時(shí)，收獲腫瘤和主要器官進(jìn)行離體NIR-II熒光生物成像。值得注意的是，即使可以看到上述兩組腫瘤中的比較光信號(hào)強(qiáng)度，mCu&Ce@ICG/RGD處理的肝臟的強(qiáng)度明顯低于mCu@ICG/RGD（圖 4 B）。此處，前者相對(duì)快速的生物降解行為有利于肝臟清除。因此，腫瘤與周圍正常組織的比例通過半定量平均NIR-II信號(hào)強(qiáng)度來計(jì)算。mCu&Ce@ICG/RGD 在注射后 24 小時(shí)的數(shù)值比 mCu@ICG/RGD 高 6 倍（圖 4D）。此外，本文還通過MRI 驗(yàn)證了Cu 基納米平臺(tái)對(duì)腫瘤的特異性識(shí)別，以臨床Gd-DTPA 為對(duì)照。根據(jù)不同時(shí)間間隔的連續(xù) T1WI MRI 生物圖像，足底注射 mCu&Ce@ICG/RGD 的淋巴轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的 MRI 信號(hào)在注射后 24 小時(shí)急劇增加至峰值水平，從此時(shí)間點(diǎn)開始逐漸衰減至基礎(chǔ)強(qiáng)度（圖 4C）。然而，由于 Gd-DTPA 的快速排泄，可以在注射后 2 小時(shí)發(fā)現(xiàn)最高的腫瘤積累。我們的納米平臺(tái)在 24 小時(shí)的腫瘤與組織比明顯高于 Gd-DTPA（圖 4E），進(jìn)一步證明了mCu&Ce@ICG/RGD有效的腫瘤靶向能力，此時(shí)最合適進(jìn)行激光照射進(jìn)行PTT。最后，研究了皮下骨肉瘤小鼠尾靜脈注射PBS、mCu&Ce@ICG和mCu&Ce@ICG/RGD后在體內(nèi)的光熱轉(zhuǎn)換效果。具體而言，納米制劑處理的腫瘤部位溫度急劇變化，升高到峰值（分別為48.9和52.8°C），并且最大光熱維持率（圖 4F，G）。毫無疑問，這種現(xiàn)象主要?dú)w因于RGD修飾的主動(dòng)靶向能力。對(duì)于PBS處理的小鼠，即使經(jīng)過300秒的照射，溫度也僅略有升高（39.8°C）（圖 4F，G）。因此，上述體內(nèi)生物成像結(jié)果凸顯了多模對(duì)比納米劑在腫瘤診斷方面的潛力和令人滿意的腫瘤抑制熱療性能。

圖5.  體內(nèi) PTT CDT 和 ICD 評(píng)估

 

基于上述基于Cu&Ce的納米平臺(tái)在體外具有良好的細(xì)胞殺傷力和出色的腫瘤蓄積效果，我們建立了143b腫瘤異種移植小鼠模型，以進(jìn)一步研究mCu&Ce@ICG/RGD在體內(nèi)的PTT/CDT/ICD協(xié)同治療效果。為了驗(yàn)證我們的程序化治療假設(shè)，給皮下患有骨肉瘤的小鼠施用六種不同的配方（PBS、L、mCu@ICG/RGD、mCu&Ce@ICG/RGD、mCu@ICG/RGD + L和mCu&Ce@ICG/RGD + L）。如圖 5A -D所示，接受PBS或激光治療的小鼠的腫瘤組織在整個(gè)治療過程中迅速生長(zhǎng)，證實(shí)單獨(dú)使用808nm激光（ 5分鐘，1.5W/cm2 ）對(duì)腫瘤生長(zhǎng)幾乎沒有抑制作用。不出所料，與具有部分消融效果的 mCu@ICG/RGD 相比，由于生物降解速度更快，用mCu&Ce@ICG/RGD 處理的腫瘤生長(zhǎng)抑制率相對(duì)較高，相比之下，納米粒子加激光照射組的腫瘤體積和腫瘤重量均得到明顯控制。有趣的是，與其他組相比，mCu&Ce@ICG/RGD + L 給藥的腫瘤基本被抑制，腫瘤抑制率明顯較低。顯然，這種徹底的根除效率可能歸因于協(xié)同 PTT 增強(qiáng)的 ROS 擴(kuò)增。結(jié)果顯示，激光照射后給予mCu&Ce@ICG/RGD可顯著延長(zhǎng)小鼠壽命，超過90%的治愈小鼠存活超過100天，而接受PBS治療的小鼠均在42天內(nèi)死亡（圖 5E），充分表明我們基于Cu&Ce的PTT-CDT協(xié)同療法具有最佳的腫瘤抑制性能。
 
總之，本文設(shè)計(jì)并成功制備了一個(gè)迷人的納米平臺(tái)，該平臺(tái)由用于 CDT 和 MRI 的介孔Cu&Ce 氧化物納米球、用于 NIR-II 造影劑和PTT 的負(fù)載 ICG 以及用于靶向基序的 RGD 組成。這種有前途的納米治療劑具有無與倫比的優(yōu)勢(shì)，例如對(duì)骨肉瘤組織的精確識(shí)別、用于腫瘤輪廓區(qū)分的 NIR-II 熒光生物成像和 MRI 以及通過 PTT 評(píng)估的 CDT 和激活的ICD 進(jìn)行的程序化抗癌性能。通過在體外有效誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡以及在體內(nèi)強(qiáng)力根除實(shí)體骨肉瘤并顯著延長(zhǎng)存活率來證實(shí)治療效果。此外，出色的生物安全性能也在體內(nèi)得到體現(xiàn)。該研究為促進(jìn)臨床惡性腫瘤的靶向診斷和治療開發(fā)了一種獨(dú)特的范例。

 

參考文獻(xiàn)

heng, M., Kong, Q., Tian, Q. et al. Osteosarcoma-targeted Cu and Ce based oxide nanoplatform for NIR-II fluorescence/magnetic resonance dual-mode imaging and ros cascade amplification along with immunotherapy. J Nanobiotechnol 22, 151 (2024).

 

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