流筆記

周期數據質量評估

工欲善其事，必先利其器。漂亮的細胞周期數據離不開性能優(yōu)異的儀器，因此，首先需要通過《中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標準YY/T 0588-2017》^[1]來評估流式細胞儀的性能。本文中使用BD的DNA質量控制試劑盒，對層浪流式細胞儀檢測到的DNA數據進行質量評估。

DN質量控制試劑盒內容：

🔶 小雞紅細胞核（CEN）：用于建立測試條件。

CEN試劑經過特殊處理，內含單個核、雙聯體核、三聯體核和更大的聚集體，用來檢測儀器的線性度和分辨率。經PI染色后，由于細胞核聚集程度的不同，在PI的直方圖中會出現至少4個峰，前4個峰分別代表單個核、雙聯體核、三聯體核和四聯體核。若染色正常，儀器線性度良好，則四個峰所在道數的平均比值接近1:2:3:4。

🔶 小牛胸腺細胞核（CTN）：具有一個完整的細胞周期，且具有細胞周期的各個時期，大部分核處于G0/G1期，小部分處于S期和G2/M期。還可作為細胞周期統(tǒng)計分析的質控。

🔶 2μm的熒光微球：作為一種穩(wěn)定的非生物標準品來確認儀器的CV（細胞離散度），要求儀器CV＜2.3%。

🔶核酸染料碘化丙啶（PI）

圖1：DNA QC試劑盒數據

數據評估結果：01

1. 出現明顯7峰，且檢測CEN結果為（圖1A）PK1:PK2:PK3:PK4:PK5:PK6:PK7 = 1.00:2.00:2.99:3.97:4.94:5.93:6.87 (≈1:2:3:4:5:6:7)。

【行業(yè)要求CEN結果滿足至少出現4個峰，且前四個峰的比值接近1:2:3:4】02

2. CTN檢測結果為周期擬合G2/G1=2.01（圖1B）。

【行業(yè)要求G2/M與G0/G1的平均熒光強度比值在1.95-2.05之間】03

3. 2μm微球結果CV=1.75%（圖1C）。

【行業(yè)要求CV＜2.3%】

綜上可得，層浪流式細胞儀在DNA檢測中表現良好，QC數據均遠超行業(yè)標準，滿足臨床/科研實驗需求，是流式分析細胞周期的卓越選擇。
 

細胞周期應用場景1、細胞系

細胞系是周期實驗研究常用的樣本，如圖2分別依次為A圖：MCF-7乳腺癌細胞系、B圖：MDA-MB-231乳腺癌細胞系、C圖：HL-7702[L-02;LO2]肝細胞系。不同細胞系周期檢測及擬合結果如下圖所示：

圖2：常見細胞系自動周期擬合

數據分析與解讀

1. 三種細胞系檢測到的CVG1值分別為：

MCF7-1.63%、231-2.09%、LO2-2.93%。

【正常二倍體的CVG1應＜8%】

注：G0/G1峰的CV（CVG1）顯著影響S期計算的準確性，然而在實際應用中，由于腫瘤樣本會存在多個亞群，其CVG1值可能會偏高，影響結果。建議將CVG1＜8%的腫瘤樣本用于有用的S期測定。

2. 檢測到的RCS（限制性立方樣條回歸，用來反映樣本的擬合程度）分別為：3.55、2.78、3.70。

【RCS＜3.0，表示擬合良好；RCS在3.0-5.0，被認為是基本擬合；RCS＞5.0，表明擬合匹配度差】

2、生殖細胞

在生殖相關研究中，生殖細胞不同時期百分比的變化一直是研究的重點。以C57BL/6小鼠精囊為例，可以檢測到不同時期的細胞數量百分比：亞倍體（sub1N）細長精子細胞；單倍體（1N）圓形精子細胞；二倍體（2N）精原細胞；四倍體（4N）精原細胞G2M期。使用層浪流式細胞儀PI檢測精細胞周期結果如圖3所示：

圖3：C57BL/6小鼠精囊周期檢測

數據分析與解讀

亞倍體（sub1N）和單倍體（1N）百分比為64.66%、二倍體（2N）百分比為7.52%、四倍體（4N）的百分比為20.84%，與文獻報道中正常C57BL/6生殖細胞占比一致。^[2]

3、植物細胞

植物細胞的多倍化對于研究個體生長發(fā)育具有重要的生物學意義。流式細胞儀檢測植物倍體具有簡單、快速、準確、直觀等優(yōu)點，在植物學中有著越來越廣泛的應用價值。模式生物擬南芥是植物倍體研究的經典角色，用層浪流式細胞儀對其葉片倍體進行檢測和分析，得到圖4結果：

圖4：擬南芥葉片周期檢測

數據分析與解讀
1.PK1:PK2=1:1.9，接近1:2。
注：植物周期檢測一般不用周期擬合軟件擬合，根據標準品確定樣本有單倍體、二倍體、四倍體，或者多倍體。植物可以檢測的樣本有：根、莖、葉、種子、花等。

 總結一鍵擬合功能示意

層浪流式細胞儀對DNA QC試劑盒（CEN/CTN/微球）的各項檢測結果均表現優(yōu)異，表明儀器的性能不僅滿足各類樣本細胞周期檢測的需求，其檢測結果更是遠優(yōu)于行業(yè)檢測標準的要求，特別是CEN檢測，可以檢測出多個峰值，且符合倍比關系。

除此之外，層浪流式細胞儀分析軟件ModelFlower內置細胞周期分析功能，可以對周期數據進行一鍵擬合，并有批量分析與批量數據導出的功能。

注意事項
· 除去碎片之外，建議可供分析的目的細胞在1萬以上，雖然細胞數據過大會影響到分析的速度，但不會對細胞各個時期的百分比檢測產生影響，擬合效果反而更好，因此在條件允許的情況下，收集量多多益善。擬合不準確可以自行調整嗎？
· 自動擬合之后如不滿意結果，也可以通過手動調整的方式，改變G1和G2門的位置，還可以批量應用到其他樣本中以保持一致性。
· 首先，不同細胞系的擬合效果存在差異。其次，影響周期擬合效果的因素還有：試劑盒差異、細胞固定方式的影響、收集細胞量的差異、人為操作影響等。因此，為了盡量減少差異，操作標準要規(guī)范，最大程度上避免操作誤差。|流筆

參考文獻

[1]中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標準YY/T 0588-2017,流式細胞儀.國家食品藥品監(jiān)督管理局.2017.

[2]R.B. Struijk,1 C.M. De Winter-Korver,1 S, Simultaneous Purifification of Round and Elongated Spermatids from Testis Tissue Using a FACS-Based DNA Ploidy Assay，International Society for Advancement of Cytometry.

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