PEAKS在乳腺癌新抗原精準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)的應(yīng)用
乳腺癌是女性乳房組織中發(fā)生的一種惡性腫瘤，盡管男性也可能患有乳腺癌，但女性是其主要發(fā)病人群，占所有女性癌癥發(fā)病的約25％；盡管在過去的幾十年治療有很大進(jìn)展，但轉(zhuǎn)移性乳腺癌仍然是無法治愈的。從免疫學(xué)的角度來看，激素受體陽性乳腺癌(HR+)被認(rèn)為是免疫上“冷”腫瘤，并沒有受益于最近的免疫治療進(jìn)展。相比之下，三陰性乳腺癌(TNBC)亞型在免疫上屬于“熱”腫瘤。白細(xì)胞浸潤和對免疫檢查點(diǎn)封鎖(ICB)的反應(yīng)性證明了這一點(diǎn)。HR+和TNBC腫瘤免疫原性差異的原因尚不清楚，CD8+ T細(xì)胞是抗腫瘤反應(yīng)的主要效應(yīng)器，可識別MHC I相關(guān)肽(MAPs)，HR+和TNBC中MAP庫的差異或許可解釋這種差異。
2024年1月，加拿大蒙特利爾大學(xué)的Pierre Thibault教授課題組在The Journal of Clinical Investigation上發(fā)表了題為“Breast cancer immunopeptidomes contain numerous
shared tumor antigens”的文章，該文章使用質(zhì)譜法，對26例原發(fā)性乳腺癌樣本進(jìn)行了全面的蛋白質(zhì)基因組學(xué)分析。研究者利用每個樣本的RNA-Seq數(shù)據(jù)建立了包含內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄因子（ERE）蛋白質(zhì)組、smRNA蛋白質(zhì)組、及癌癥特異性蛋白質(zhì)組的個性化參考數(shù)據(jù)庫，利用PEAKS軟件對每個樣本的質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定出共57094個MHC I相關(guān)肽。接下來，將乳腺癌TCGA樣本分為異常表達(dá)的腫瘤特異性新抗原 (aeTSAs)數(shù)量高和低兩組，并對兩組進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，通過白細(xì)胞浸潤基因標(biāo)記進(jìn)行基因集富集分析（GSEA）闡述了異常表達(dá)腫瘤新抗原（aeTSAs）的免疫浸潤結(jié)果。本研究還進(jìn)行了特異性T細(xì)胞功能擴(kuò)增（FEST）試驗評估了鑒定抗原的免疫原性以及總生存率分析評估了腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）和異常表達(dá)腫瘤特異性新抗原（aeTSAs)的數(shù)量是否與TCGA中患者的總生存期相關(guān)。
研究方法
該研究選取了26例原發(fā)性乳腺癌樣本：HR+ (ER或PR陽性，HER2陰性；n=14)或TNBC (ER/PR/HER2陰性；n=12)，腫瘤組織通過免疫沉淀獲得MHC I免疫組，通過RNA-seq構(gòu)建個性化數(shù)據(jù)庫，并使用PEAKS X Pro在相關(guān)數(shù)據(jù)庫中檢索LC-MS/MS數(shù)據(jù)（方法如下圖所示），隨后對鑒定出的免疫肽進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，免疫原性分析，特異性T細(xì)胞功能擴(kuò)增(FEST)試驗以及TAAs和aeTSAs的數(shù)量是否與TCGA中患者的總生存期相關(guān)分析。
shared tumor antigens”的文章，該文章使用質(zhì)譜法，對26例原發(fā)性乳腺癌樣本進(jìn)行了全面的蛋白質(zhì)基因組學(xué)分析。研究者利用每個樣本的RNA-Seq數(shù)據(jù)建立了包含內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄因子（ERE）蛋白質(zhì)組、smRNA蛋白質(zhì)組、及癌癥特異性蛋白質(zhì)組的個性化參考數(shù)據(jù)庫，利用PEAKS軟件對每個樣本的質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定出共57094個MHC I相關(guān)肽。接下來，將乳腺癌TCGA樣本分為異常表達(dá)的腫瘤特異性新抗原 (aeTSAs)數(shù)量高和低兩組，并對兩組進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，通過白細(xì)胞浸潤基因標(biāo)記進(jìn)行基因集富集分析（GSEA）闡述了異常表達(dá)腫瘤新抗原（aeTSAs）的免疫浸潤結(jié)果。本研究還進(jìn)行了特異性T細(xì)胞功能擴(kuò)增（FEST）試驗評估了鑒定抗原的免疫原性以及總生存率分析評估了腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）和異常表達(dá)腫瘤特異性新抗原（aeTSAs)的數(shù)量是否與TCGA中患者的總生存期相關(guān)。
研究方法
該研究選取了26例原發(fā)性乳腺癌樣本：HR+ (ER或PR陽性，HER2陰性；n=14)或TNBC (ER/PR/HER2陰性；n=12)，腫瘤組織通過免疫沉淀獲得MHC I免疫組，通過RNA-seq構(gòu)建個性化數(shù)據(jù)庫，并使用PEAKS X Pro在相關(guān)數(shù)據(jù)庫中檢索LC-MS/MS數(shù)據(jù)（方法如下圖所示），隨后對鑒定出的免疫肽進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，免疫原性分析，特異性T細(xì)胞功能擴(kuò)增(FEST)試驗以及TAAs和aeTSAs的數(shù)量是否與TCGA中患者的總生存期相關(guān)分析。
數(shù)據(jù)搜索的工程流程研究結(jié)果
研究結(jié)果
1. HR+和TNBC腫瘤的典型免疫肽組相似
作者利用大型免疫肽數(shù)據(jù)集來發(fā)現(xiàn)假定的乳腺癌MAP，MAPs of interest (MOIs)被分類為TAAs、aeTSAs或mTSAs，工作流程如圖2A所示。最終，該研究確定了25個TSA(1個mTSA、24個aeTSA）和49種TAAs，其中大部分未被列入免疫表位數(shù)據(jù)庫(IEDB)(圖2B、C)。
3. TSAs在TNBC中比HR+乳腺癌更豐富
在24個aeTSAs中，17個由典型外顯子編碼：14個來源于癌胚抗原(CTA)的MAGE family CTAs家族，2個來源于編碼細(xì)胞外基質(zhì)成分的基因(COL11A1, ITH6)，1個來源于跨膜蛋白編碼基因(ABCC11)；7個aeTSAs來源于非蛋白質(zhì)編碼區(qū)，2個與EREs重合，為ERE-derived MAP(圖3)。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，TNBC樣品中aeTSAs 更豐富(圖2 B)。研究者進(jìn)一步評估TNBC樣本中aeTSAs的豐富鑒定是否與TCGA隊列中的TSA表達(dá)相關(guān)。在TNBC中，表達(dá)癌胚抗原 (CTA)類腫瘤個體aeTSAs的比例高于HR+腫瘤(19%比8%，P = 0.004)(圖3C)。將乳腺癌TCGA樣本分為高(高于中位數(shù))和低(低于中位數(shù))aeTSAs數(shù)量兩組，使用白細(xì)胞浸潤標(biāo)記基因進(jìn)行GSEA分析，結(jié)果顯示，這些基因在高TSA數(shù)量的腫瘤中富集(圖3D)，這表明一些TSAs在體內(nèi)具有免疫原性。
4. TAAs在乳腺癌中有很高的比例
作者鑒定了49種TAAs，其中有48種來源于規(guī)范蛋白編碼區(qū)(圖4A)，這些抗原在HR+和TNBC腫瘤中都具有高度的共通性(圖4B)。14種TAAs來源癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)標(biāo)志物的基因(COL11A1, COL10A1, LRRC15)，這些基因與細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和細(xì)胞遷移有關(guān)。13種TAAs來源于CYP4Z1，它與許多癌癥類型有關(guān)，并在乳腺癌患者中引發(fā)自身抗體。11個TAAs與細(xì)胞增殖有關(guān)(圖4B)，其在成熟上皮細(xì)胞和血細(xì)胞中低水平表達(dá)，但在骨髓祖細(xì)胞中高水平表達(dá)(圖4A)。使用與aeTSA相同的標(biāo)準(zhǔn)來預(yù)測TCGA數(shù)據(jù)集中每個腫瘤的TAAs數(shù)量(圖4C)。結(jié)果顯示高水平TAAs的HR+和TNBC腫瘤存在免疫激活和免疫抑制通路富集，包括PI3K/mTOR、Wnt/B-catenin和MAPK通路。此外，含有大量TAAs的腫瘤顯示出成纖維細(xì)胞增殖標(biāo)志物的富集。這些發(fā)現(xiàn)表明，在存在多種TAAs的情況下，抗腫瘤免疫反應(yīng)受到免疫抑制通路的激活和CAFs的積累所調(diào)節(jié)。
5.TAS和TAAs的免疫原性
為了評估已鑒定抗原的免疫原性，作者進(jìn)行了特異性T細(xì)胞功能擴(kuò)增(FEST)試驗，檢測了2名健康獻(xiàn)血者HLA異型呈現(xiàn)的11種不同抗原(7種TSA和4種TAAs)(圖6)。陽性對照為免疫原修飾的MelanA drived MAP(ELAGIGILTV)和呼吸道合胞病毒RSV-NL9肽(NPKASLLSL)。結(jié)果顯示7種TSAs刺激后，TCR Vβ克隆型顯著擴(kuò)增(從3個擴(kuò)增到39個)，4種TAAs中有3個表現(xiàn)出2到37個克隆型的顯著擴(kuò)增，新抗原特異性TCR克隆型的數(shù)量與抗腫瘤反應(yīng)相關(guān)。這些結(jié)果顯示MAP刺激健康受試者后，免疫系統(tǒng)中存在多克隆且功能正常的TAAs和TSAs特異性T細(xì)胞，這些細(xì)胞對于腫瘤免疫治療的成功起著重要作用，有助于對抗腫瘤細(xì)胞。
6.TAS提高了TNBC患者的總體生存率
作者進(jìn)一步評估了TAAs和aeTSAs的數(shù)量是否與TCGA患者的總生存率相關(guān)，結(jié)果顯示TAAs的數(shù)量對HR+或TNBC腫瘤患者的生存沒有影響(圖7A，B)。同樣，aeTSAs對HR+腫瘤患者也沒有影響(圖7C)。然而，在TNBC組中，aeTSAs越多，總生存率越高(圖7D)，從MAGE基因和非編碼區(qū)提取的aeTSA中也可以觀察到這種優(yōu)勢，且這種影響是受HLA限制(圖7E，F(xiàn))。因此可以得出結(jié)論，aeTSAs在TNBC患者可以提高生存優(yōu)勢(圖7D)，而HR+腫瘤中沒有這種情況(圖7C)，可能是因為HR+腫瘤的aeTSAs比TNBC腫瘤更少(圖3C)。
結(jié)論
本文通過質(zhì)譜方法及并利用蛋白組學(xué)構(gòu)建個性化數(shù)據(jù)庫對14例激素受體陽性（HR+）和12例三陰性乳腺癌（TNBC）患者的MHC I相關(guān)肽進(jìn)行了分析，鑒定出57094種獨(dú)特的MAPs，發(fā)現(xiàn)了25個TSAs和49個TAAs，這些抗原可作為癌癥免疫治療的潛在靶點(diǎn)，并進(jìn)一步比較了TNBC和HR+乳腺癌的免疫肽組，二者表現(xiàn)出源基因高度重疊、mTSAs極為罕見、TAAs在兩者中大量高度共享這些相似性，也表現(xiàn)出免疫肽組學(xué)差異性，即aeTSA經(jīng)常在TNBC中發(fā)現(xiàn)，但很少在HR+腫瘤中發(fā)現(xiàn)。這些結(jié)果對于了解免疫系統(tǒng)如何識別和攻擊乳腺癌細(xì)胞以及開發(fā)免疫治療策略具有重要意義。
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