當前位置 > 首頁 > 技術文章 > 通過調節(jié)Ideonella sakaiensis菌株產(chǎn)生的PET降解酶的糖基化修飾詳解

通過調節(jié)Ideonella sakaiensis菌株產(chǎn)生的PET降解酶的糖基化修飾詳解

瀏覽次數(shù)：480　發(fā)布日期：2024-10-24　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)是最常用的合成塑料之一^[1]。由于耐用性、彈性、強度和耐化學腐蝕性均較高，被廣泛應用于紡織、包裝和包裝瓶制造行業(yè)。但這些特性同時也使得PET很難被自然降解，大量使用及不當處理造成環(huán)境污染。自2005年以來，許多PET生物酶被發(fā)現(xiàn)，其中，大阪堺菌（Ideonella sakaiensis）產(chǎn)生的PET酶（IsPETase）對PET的降解效果良好，但它對溫度非常敏感，37℃下24小時內就會大部分失活，因此需要對該酶進行改造以提高穩(wěn)定性和活性，從而實現(xiàn)大規(guī)模、低成本地制造，從實驗室轉化到工業(yè)規(guī)模對PET進行降解。畢赤酵母是一種常用的工業(yè)生產(chǎn)外源性蛋白的菌種^[2,3]，該表達體系會對蛋白產(chǎn)生豐富的糖基化修飾，從而提高產(chǎn)量，增加蛋白抗性。

湖北大學生命科學學院的馬立新教授和翟超博士合作發(fā)表題為“Improving the activity and thermostability of PETase from Ideonella sakaiensis through modulating its post-translational glycan modification”的研究成果。本研究發(fā)現(xiàn)畢赤酵母的糖基化修飾使其成為IsPETase異源表達的優(yōu)選宿主。由于豐富的N-link和O-link糖基化修飾，IsPETase的比活性和熱穩(wěn)定性顯著提高。此外，在被Endo-β- nacetylglucosaminidase H (Endo H)切除部分N糖鏈后，IsPETase的比活性進一步增加。重要的是，部分去糖基化的IsPETase仍然保持較高的熱穩(wěn)定性，能夠在50°C下，2至3天內完全降解未經(jīng)處理的PET制品碎片。該研究中LC-MS/MS數(shù)據(jù)的N糖和O糖基化位點分析使用PEAKS^®GlycanFinder完成。

重組IsPETase的產(chǎn)率隨著目標基因拷貝數(shù)的增加而增加

構建IsPETase基因拷貝為1~4的重組畢赤酵母GS115菌株（GS115-IP-1、GS115-IP-2、GS115-IP-3、GS115-IP-4），進行搖瓶發(fā)酵。誘導5d后，重組蛋白的產(chǎn)率分別達到0.13、0.25、0.48和0.60 mg/mL，表明重組IsPETase（IsPETasePp）的表達量隨基因拷貝數(shù)的增加而增加。發(fā)酵上清液的SDS-PAGE顯示，誘導5天后，檢測到部分條帶（Fig. S1a），糖蛋白染色結果證實了畢赤酵母對目標蛋白的糖基化修飾(Fig. S1b)。用自制Endo H去除IsPETasePp的多糖鏈后，觀察到明顯的條帶，證明切糖成功(Fig. S1c)，糖蛋白染色也證明了這點 (Fig. S1d)。

Fig. S1 發(fā)酵上清液蛋白膠圖

部分脫糖IsPETase-Pp的特性

經(jīng)測定，部分脫糖的IsPETase-Pp的最適溫度為50℃(Fig.1a)，高于先前的文獻報道^[4]。此外，與之前的報道相比，部分脫糖IsPETase-Pp的熱穩(wěn)定性更高，在50℃下孵育2小時后，其活性仍保持在90%左右。在60°C和70°C時，活性急劇下降，在2小時后活性不到20% (Fig.1b)。

Fig. 1 IsPETase-Pp熱穩(wěn)定性測定

高密度發(fā)酵制備IsPETase酶

搖瓶發(fā)酵的原料和培養(yǎng)條件與工業(yè)化的大規(guī)模發(fā)酵完全不同，且有報道指出高密度表達會使宿主細胞分泌蛋白時發(fā)生應激反應，導致重組蛋白在內質網(wǎng)或高爾基復合體中停留時間延長，從而使得多糖鏈更長，抑制IsPETase-Pp的催化活性。為探究IsPETase-Pp在工業(yè)條件下的糖基化修飾情況，以GS115-IP-4為例，采用高密度發(fā)酵制備IsPETase-Pp。與搖瓶發(fā)酵相比，Is PETase-Pp的表達量明顯提高，5天后達最大值，產(chǎn)量約為1.20 g/L。糖基化染色結果表明目標蛋白的糖基化程度比較高（Fig. 2a、b）。經(jīng)Endo H處理后，觀察到3個主要條帶（Fig. 2c、d）。下方兩個條帶為IsPETase-Pp，上方一條帶為畢赤酵母dihydrolipoyl Dehydrogenase。

Fig. 2 高密度發(fā)酵表達的脫糖IsPETase

部分脫糖IsPETase-Pp的催化活性和熱穩(wěn)定性

設定不同的Endo H實驗條件，觀察處理后的Is PETase-Pp催化活性，結果如Fig. 3a�？梢钥闯觯l(fā)酵上清液幾乎沒有任何活性，因為培養(yǎng)基中的金屬離子，尤其是Fe3+會顯著抑制酶的催化活性。用10 kDa超濾膜過濾上清液后，酶活性明顯提高。并且無論是超濾前還是超濾后用Endo H處理樣品，酶活性均顯著提高。此外，用PNGase F酶切除完整N糖鏈后的酶活性有所提高，但比Endo H處理后的活性低一些。然后，作者探索了Endo H的處理時間，結果表明用667 nM Endo H處理0.5 h后可以保持較高的初始活性（Fig. 3b）。

Fig. 3 IsPETase-Pp脫糖條件優(yōu)化

接下來，作者研究了部分脫糖IsPETase-Pp在40℃、45℃和50℃的熱穩(wěn)定性。結果表明，該酶在40℃下非常穩(wěn)定，12小時后完全保持活性。在45℃下12小時后保持約60％的活性。在50℃下，酶在6小時后仍保留40％以上的活性（Fig. 4a）。而先前報道的IsPETase-Ec[5]在同樣條件下1h內幾乎全部失活，SDS-PAGE結果一致（Fig. 4b）。進一步的動力學實驗發(fā)現(xiàn)部分脫糖IsPETase-Pp的絕大部分降解產(chǎn)物為TPA。

Fig. 4 部分脫糖IsPETase-Pp的熱穩(wěn)定性

IsPETase-Pp的糖基化修飾分析
IsPETase有8個潛在的N糖基化位點，且位點基本分布在蛋白表面，作者通過LC-MS/MS在這8個位點上均鑒定到了糖基化修飾。其中，N114、N138、N212、N264和N288位點信號較高，N190、N205和N277的信號較弱(N代表Asn)。值得注意的是，N205后面的Asp206屬于IsPETase的催化三元體。由于N205信號較弱，推斷糖基化對水解中心的影響很小，這意味著糖基化通過屏蔽酶分子而不是阻斷催化位點來抑制酶的催化活性。此外，還發(fā)現(xiàn)了19個潛在的O糖基化位點，與N糖相比，O糖相對較短，糖基化蛋白的比例更低，因此屏蔽作用要弱得多，這也解釋了為什么Endo H處理足以恢復蛋白質的活性。

Fig. S10 N277位點的糖基化修飾譜

Fast-PETase在畢赤酵母GS115中的表達

近期一種熱穩(wěn)定性和活性更高的IsPETase突變蛋白Fast-PETase被合成出來[6]。作者測試了該變體的制備策略。在Fast-PETase中，糖基化位點和突變位點之間沒有重疊，SDS-PAGE結果表明Fast-PETase-Pp在搖瓶和高密度發(fā)酵過程中也被大量糖基化(Fig. 5a)。在Endo H處理后活性也顯著提高(Fig. 5b)。此外，部分脫糖Fast-PETase-Pp具有較高的熱穩(wěn)定性。在50℃、55℃和60℃下孵育12 h后，催化活性分別保持在80%、70%和60%以上。在65°C時，其熱穩(wěn)定性急劇下降，12小時后僅保留10%的活性。在70°C時，3小時內全部失去活性(Fig. 5c)。

Fig. 5 高密度發(fā)酵制備Fast-PETase-Pp

未處理的PET用品降解測試

隨機購買白色和黑色PET托盤制品各一份，使用重組IsPETase和Fast-PETase分別進行降解測試。部分脫糖IsPETase-Pp在2天內降解了黑色托盤薄片（圖 6a）。HPLC結果顯示PET幾乎以線性速度被降解(Fig. 6b)。而部分脫糖Fast-PETase-Pp的降解速度更快，在2d內，補酶一次可使PET薄片完全降解。此外，部分脫糖Fast-PETase-Pp在50°C下，3天內即可完全降解5.4 g黑色PET托盤(Fig. 6c)。但對PET水瓶的降解能力不明顯。

Fig. 6 PET薄片制品的降解測試

小結

作者探索了高密度發(fā)酵制備的IsPETase-Pp的實驗條件，并利用Endo H對IsPETase-Pp進行部分切糖處理，以提高酶的熱穩(wěn)定性和活性。為大規(guī)模制備IsPETase-Pp及其蛋白變體提供了參考依據(jù)，也為推動PET生物降解從實驗室走向工業(yè)化奠定了基礎。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s42003-023-04413-0#Sec29

若您想深入了解更多PEAKS GlycanFinder的功能和應用，歡迎掃描下方二維碼提交您的咨詢信息！

參考文獻
1.Magalhães, R. P., Cunha, J. M. & Sousa, S. F. Perspectives on the Role of Enzymatic Biocatalysis for the Degradation of Plastic PET. Int. J. Mol. Sci. 22, 2011257 (2021).
2.Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C. & Cregg, J. M. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. Curr. Opin. Biotechnol. 13, 329–332 (2002).
3. Cereghino, G. P. & Cregg, J. M. Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 10, 422–427 (1999).
4. Yoshida, S. et al. A bacterium that degrades and assimilates poly(ethylene terephthalate). Science 351, 1196–1199 (2016).
5. Wang, F. et al. High-level expression of endo-β-N-acetylglucosaminidase H from Streptomyces plicatus in Pichia pastoris and its application for the deglycosylation of glycoproteins. PLoS One 10, e0120458 (2015).
6. Lu, H. et al. Machine learning-aided engineering of hydrolases for PET depolymerization. Nature 604, 662–667 (2022).

-掃碼關注-
www.bioinfor.com (EN)
www.deepproteomics.cn（CN）

作為生物信息學的領軍企業(yè)，BSI專注于蛋白質組學和生物藥領域，通過機器學習和先進算法提供世界領先的質譜數(shù)據(jù)分析軟件和蛋白質組學服務解決方案，以推進生物學研究和藥物發(fā)現(xiàn)。我們通過基于AI的計算方案，為您提供對蛋白質組學、基因組學和醫(yī)學的卓越洞見。旗下著名的PEAKS®️系列軟件在全世界擁有數(shù)千家學術和工業(yè)用戶，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，DeepImmu®️ 免疫肽組發(fā)現(xiàn)服務和抗體綜合表征服務等。
聯(lián)系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com

索取資料

來源：百蓁生物科技（上海）有限公司
聯(lián)系電話：021-60919881
E-mail：sales-china@bioinfor.com

【點擊可查看百蓁生物科技（上海）有限公司相關產(chǎn)品】

分享到：QQ空間新浪微博騰訊微博微信

【所有文章】【本類新聞】【相關產(chǎn)品】【關閉窗口】

本類文章

本類新聞

综合图区亚洲网友自拍|亚洲黄色网络|成人无码网WWW在线观看,日本高清视频色视频kk266,激情综合五月天,欧美一区日韩一区中文字幕页

通過調節(jié)Ideonella sakaiensis菌株產(chǎn)生的PET降解酶的糖基化修飾詳解