近年來，為更快地將創(chuàng)新療法帶給患者，加快藥物開發(fā)進程已成為生物制藥行業(yè)的主要關(guān)注點。重組中國倉鼠卵巢 （CHO） 細胞系是單克隆抗體 （mAb） 的主要表達系統(tǒng)，為了加快生物制藥進程，如何提高宿主細胞外源基因表達量及穩(wěn)定性水平是個棘手的熱門話題，目前通常通過將遺傳信息隨機轉(zhuǎn)基因整合 （RTI：Random Transgene Integration）到宿主細胞基因組中產(chǎn)生，即通過選擇性標記進行多輪篩選以獲得具有高表達水平的克隆。而由于缺乏對隨機整合插入位點的控制，部分克隆細胞系的重組蛋白生產(chǎn)力可能會隨著時間的推移而減少，導致細胞系不穩(wěn)定。因此，RTI代表了一種容易出錯且乏味的方法，導致開發(fā)時間很長。定點整合 （SSI：Site-Specific Integration） 被確定為 RTI的一種有前途的替代品，因為它可以更快速地生成高性能和穩(wěn)定的生產(chǎn)細胞系，加速藥物開發(fā)進程。
 

RTI技術(shù)與SSI技術(shù)區(qū)別
 

基于RTI（上圖）與SSI（下圖）的細胞系開發(fā)過程圖示^[1]
 

在基于RTI的細胞系開發(fā)過程中，攜帶轉(zhuǎn)基因遺傳信息和選擇標記的線性化質(zhì)粒穩(wěn)定地整合到CHO宿主細胞的基因組中。因此，具有不可預測結(jié)構(gòu)的多拷貝轉(zhuǎn)基因整合將發(fā)生在未知基因組位點上，代謝選擇后產(chǎn)生的細胞庫顯示出高水平的基因組和表型多樣性。對于基于SSI的CLD，能夠在基因組的特定位點精確插入或整合外源DNA片段，從而實現(xiàn)對特定基因的添加、刪除或替換，可使得細胞庫顯示出較低的表型異質(zhì)性。相比于RTI，SSI具有高整合效率、外源基因可實現(xiàn)精確定位、基因表達具有一致性、減少位置效應使得基因表達受控、提高細胞株的安全性及簡化篩選流程等優(yōu)勢。
 

常見的SSI技術(shù)方法

1、 CRISPR-Cas系統(tǒng)：

利用CRISPR-Cas9或其他變體，結(jié)合特異性向?qū)�RNA（sgRNA），在基因組中特定位置切割DNA，并通過同源重組修復（HDR）或非同源末端連接（NHEJ）插入外源DNA。

2、 轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)：

如Sleeping Beauty、piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，通過轉(zhuǎn)座酶在特定位置插入外源基因。

3、 重組（整合）酶系統(tǒng)：

如BxB1、Cre-LoxP、FLP-FRT和PhiC31等系統(tǒng)，通過特異性識別序列進行重組，實現(xiàn)外源DNA的整合。
 

重組酶系統(tǒng)01  BxB1整合酶定點整合外源基因

Gaidukov L, Wroblewska L等人^[2]2018年發(fā)表于Nucleic Acids Research的文章，確定了21個支持轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定長期表達的新基因組位點，然后在選定的位點構(gòu)建了包含一個、兩個或三個“著陸墊”重組位點的細胞系。通過在每個位點使用高效的BxB1重組酶以及不同的選擇標記，將重組酶介導的異源DNA插入到選定的位點，包括通過單次轉(zhuǎn)染靶向所有三個位點。使用這種方法可控地整合多達9個拷貝的單克隆抗體，代表21個轉(zhuǎn)錄單元中約100 kb的異源DNA。由于整合針對預先驗證的位點，重組蛋白表達在數(shù)周內(nèi)保持穩(wěn)定，并且整合有效載荷中抗體盒的額外拷貝導致抗體表達線性增加�？傮w而言，該多拷貝位點特異性整合平臺允許將大量DNA可控且可重復地插入穩(wěn)定的基因組位點，在哺乳動物合成生物學、重組蛋白生產(chǎn)和生物制造方面具有廣泛的應用。

 

BxB1整合酶定點整合外源基因

 

02  FLP/FRT重組酶定點整合外源基因

Feary M, Moffat MA等人^[3]在2021年發(fā)表于Biotechnology Progress的文章， 將Fer1L4位點與CHOK1SV谷氨酰胺合成酶敲除 （GS-KO） 宿主相結(jié)合，創(chuàng)建了一個改進的CHOK1SV GS-KO 定點整合表達系統(tǒng)。CHOK1SV GS-KO SSI宿主是通過同源定向整合Fer1L4基因中不相容的Frt序列的靶向著陸墊創(chuàng)建的，靶向載體包含無啟動子GS表達盒和mAb表達盒，兩側(cè)是與宿主細胞系中著陸墊兩側(cè)的等效位點兼容的Frt 位點。
 

FLP/FRT重組酶定點整合外源基因圖示

 

03  Cre/Lox重組酶定點整合外源基因

Zhou M, Crawford Y等人^[4]在2021年發(fā)表于Biotechnology Progress的文章，利用Cre/Lox重組酶介導的盒式交換（RMCE）將表達抗體的盒引入預定位點，建立了CHO-K1-M衍生的SSI宿主細胞。兩個SSI宿主細胞都包含一個表達GFP的著陸墊，兩側(cè)是兩個不兼容的LoxP重組位點（L3和2L）。此外，在GFP著陸墊中插入了第三個不相容的LoxP位點（LoxFAS），以實現(xiàn)基于雙質(zhì)粒的創(chuàng)新RMCE策略，其中兩個獨立的載體可以同時靶向單個位點。

 

Cre/Lox重組酶定點整合外源基因圖示
 

目前，已有一些知名制藥企業(yè)（武田制藥、羅氏、強生等）利用智能定點整合技術(shù)優(yōu)化其生物藥物的生產(chǎn)流程，包括開發(fā)穩(wěn)定細胞株用于大規(guī)模生產(chǎn)。而利用整合酶定點整合外源基因的方式對于國內(nèi)制藥企業(yè)來說目前還是處于萌芽階段。但定點整合技術(shù)對抗體藥物開發(fā)帶來的前景是可預期的，眾多生物制藥企業(yè)一直期盼能盡快將定點整合應用于自身平臺中，加速細胞株的開發(fā)。
 

案例分享（以重組酶系統(tǒng)為例）

通過定點整合技術(shù)，將目標基因序列通過同源重組的方式轉(zhuǎn)染到已經(jīng)通過前期篩選驗證過的活躍位點當中，構(gòu)建均一細胞池。其首先需要構(gòu)建平臺細胞，利用報告基因（如GFP 等） 篩選得到宿主細胞基因組中的高表達位點，之后利用重組酶的特異性，實現(xiàn)將目標產(chǎn)品基因插入在該表達量高、質(zhì)量和表達量穩(wěn)定的宿主細胞基因組位點，再利用Cytena克隆篩選單細胞打印系統(tǒng)，獲得穩(wěn)定及高產(chǎn)的單克隆細胞株。

定點整合單克隆篩選流程

 

細胞類型：CHO-K1

細胞狀態(tài)：35%陽性率；80%活率

單細胞挑選設(shè)備：Cytena克隆篩選單細胞打印系統(tǒng)，對照組：FACS

單細胞、單克隆率：
 

通過無熒光轉(zhuǎn)化子同源同組，細胞樣品內(nèi)有帶有熒光的母細胞也有無熒光即轉(zhuǎn)化子同組成功的目的細胞，12天后采用Cytena克隆篩選單細胞打印系統(tǒng)進行無熒光細胞鋪板（只分選非熒光的細胞），單細率約為85%，克隆恢復率約為20%，而對照組流式由于分選過程對單細胞狀態(tài)及活力造成損傷，后續(xù)單細胞難以恢復成克隆。此流程可以省去minipool與有限稀釋的環(huán)節(jié)，加快開發(fā)流程，值得一提的是，用定點整合方式，經(jīng)單細胞打印系統(tǒng)分選獲得的單克隆，后續(xù)產(chǎn)量＞5g/L，約為隨機整合表達量的1.5-2倍，此流程可降低開發(fā)時間和成本，提升開發(fā)效能，大大縮短整個工藝開發(fā)及IND申報時間。

 

智能定點整合技術(shù)在單克隆細胞株篩選中具有高效、精確和安全等顯著優(yōu)勢，當然其也面臨技術(shù)復雜、成本高以及潛在脫靶效應等挑戰(zhàn)，選擇使用SSI技術(shù)需綜合考慮實驗目的、成本和技術(shù)能力等因素。
 

參考資料

[1] Schmieder V , Fieder J , Drerup R ,et al.Towards maximum acceleration of monoclonal antibody development: Leveraging transposase-mediated cell line generation to enable GMP manufacturing within 3 months using a stable pool[J].Journal of Biotechnology, 2022(349-):349.DOI:10.1016/j.jbiotec.2022.03.010.

[2] A multi-landing pad DNA integration platform for mammalian cell engineering. Nucleic Acids Res.Gaidukov L, Wroblewska L, Teague B, Nelson T, Zhang X, Liu Y, Jagtap K etc.(2018)

[3]CHOK1SV GS-KO SSI expression system: A combination of the Fer1L4 locus and glutamine synthetase selection. Biotechnol Prog.Feary M, Moffat MA, Casperson GF, Allen MJ, Young RJ.(2021)

[4]Development of a targeted integration Chinese hamster ovary host directly targeting either one or two vectors simultaneously to a single locus using the Cre/Lox recombinase-mediated cassette exchange system. Biotechnol Prog. Ng D, Zhou M, Zhan D, Yip S, Ko P, Yim M, etc.(2021)