細(xì)胞間的差異存在于任何細(xì)胞群體中，此前對(duì)細(xì)胞機(jī)制的理解還依賴于對(duì)大量細(xì)胞群體的測(cè)定�，F(xiàn)在人們普遍認(rèn)為，總體平均值可能不代表單個(gè)細(xì)胞功能，因此需要用單細(xì)胞分辨率來(lái)解析細(xì)胞“組學(xué)”（例如，基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等）。近來(lái)，單細(xì)胞DNA和RNA測(cè)序的發(fā)展使其能夠以單細(xì)胞分辨率監(jiān)測(cè)細(xì)胞譜系和細(xì)胞異質(zhì)性。然而，即使是等基因細(xì)胞（即具有相同基因型的細(xì)胞）也可能表現(xiàn)出隨機(jī)的細(xì)胞異質(zhì)性。代謝產(chǎn)物和其他成分濃度的非遺傳性細(xì)胞差異會(huì)影響細(xì)胞死亡易感性、動(dòng)力學(xué)，甚至是對(duì)統(tǒng)一致命藥物暴露的死亡模式。在癌癥治療中，連續(xù)幾輪細(xì)胞毒性化療通常會(huì)殺死腫瘤中一定比例的細(xì)胞，而不是絕對(duì)數(shù)量的細(xì)胞，這表明要么是預(yù)先存在的細(xì)胞異質(zhì)性抑制治療，要么是細(xì)胞亞群對(duì)治療的選擇性反應(yīng)，也就是說(shuō)非遺傳細(xì)胞異質(zhì)性對(duì)治療和治療的總體療效有明顯影響。

用單細(xì)胞分辨率檢測(cè)代謝物是很大的挑戰(zhàn)。在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)，有數(shù)千種獨(dú)特的化學(xué)物質(zhì)以低濃度存在，且這些化學(xué)物質(zhì)可以迅速變化，與單細(xì)胞基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)不同，代謝物沒(méi)有可用的擴(kuò)增策略，若想獲得足夠的單細(xì)胞數(shù)據(jù)以統(tǒng)計(jì)區(qū)分細(xì)胞群體或亞群體之間的差異，高靈敏度，高的單細(xì)胞采樣吞吐量是必需的。流式細(xì)胞術(shù)是最常用的單細(xì)胞測(cè)定技術(shù)之一，使用基于熒光的分子探針，以極高的通量（數(shù)千個(gè)細(xì)胞/秒）分析特定代謝物，但由于光譜特征重疊，流式細(xì)胞術(shù)只能同時(shí)測(cè)定大約十幾個(gè)分子。使用基于重金屬同位素的分子探針組合，流式細(xì)胞儀可以靶向多達(dá)48個(gè)不同的分子組分，但這仍然只代表單個(gè)細(xì)胞中存在的代謝物的一小部分。不幸的是，通過(guò)流式和質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)進(jìn)行無(wú)靶向分子分析是不可行的，即研究人員必須事先知道并選擇要研究的分子。

質(zhì)譜（MS）由于其高靈敏度、化學(xué)特異性和速度是最適合非靶向單細(xì)胞分析的技術(shù)之一。目前已有幾種基于真空和探針的質(zhì)譜技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)單細(xì)胞的全面、無(wú)靶化學(xué)分析，包括二次離子質(zhì)譜（SIMS）、基質(zhì)輔助激光/解吸電離（MALDI）和激光/解吸離子化（LDI）技術(shù)，這些技術(shù)雖然非常敏感，但需要在細(xì)胞的自然狀態(tài)之外對(duì)其進(jìn)行重大修改（例如固定和脫水），以便于在真空下進(jìn)行分析。還有幾種方法，包括活單細(xì)胞質(zhì)譜、單探針質(zhì)譜和其他方法，使用手動(dòng)引導(dǎo)的探針(移液器、光纖、毛細(xì)血管等)在原位或體內(nèi)通過(guò)環(huán)境質(zhì)譜測(cè)定細(xì)胞化學(xué)，然而，低采樣通量限制了大多數(shù)這些方法的使用，因?yàn)槊總�(gè)細(xì)胞的測(cè)定都很費(fèi)時(shí)。

隨著技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，基于MS的技術(shù)成為快速、定量和非靶向單細(xì)胞化學(xué)分析所需技術(shù)的基礎(chǔ)。然而，單細(xì)胞化學(xué)的常規(guī)定量測(cè)定仍然具有挑戰(zhàn)性。此外，為了便于分析，目前的MS平臺(tái)需要廣泛的樣品制備程序或以其他方式干擾細(xì)胞的天然狀態(tài)，這可能會(huì)對(duì)細(xì)胞化學(xué)產(chǎn)生不可預(yù)見(jiàn)的影響。為了解決這些問(wèn)題，此報(bào)道開(kāi)發(fā)了一種新的單細(xì)胞化學(xué)分析能力，利用單細(xì)胞液滴分配，然后用常壓溶劑萃取-MS方法進(jìn)行化學(xué)分析。本文證明了單細(xì)胞打印機(jī)液體渦流捕獲MS（SCP-LVC-MS）系統(tǒng)可以高采樣通量定量測(cè)定單個(gè)微藻和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的脂質(zhì)組學(xué)特征，并在分析之前不需要對(duì)細(xì)胞本身進(jìn)行任何修飾。

SCP-LVC-MS技術(shù)的工作原理是通過(guò)SCP技術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞分離，然后將液滴捕獲到LVC-MS采樣探針中，一旦暴露于適當(dāng)?shù)娜軇┲校��?xì)胞就被裂解、提取并通過(guò)MS進(jìn)行分析。SCP是一種臺(tái)式自動(dòng)液滴式細(xì)胞打印機(jī)，利用類似噴墨的分配原理與光學(xué)顯微鏡相結(jié)合，含有>1個(gè)或沒(méi)有細(xì)胞的液滴可以通過(guò)成像顯微鏡識(shí)別，并通過(guò)真空吸出，確保每滴噴出一個(gè)細(xì)胞，在實(shí)踐中，>95%的噴出液滴含有單個(gè)細(xì)胞。SCP系統(tǒng)放置在Sciex TripleTOF^®5600+質(zhì)譜儀的頂部（圖1d），LVC探針連接在SCP系統(tǒng)的底座上（圖1c）。cartridge在LVC探針正上方1mm處對(duì)齊（圖1c），確保探針捕獲所有用于分析的液滴。LVC-MS是一種利用連續(xù)流動(dòng)液體溶劑萃取的常壓MS技術(shù)，LVC-MS技術(shù)使用同軸管設(shè)計(jì)，當(dāng)在優(yōu)化的溶劑和噴霧器氣體條件下操作時(shí)，在探針的采樣端保持穩(wěn)定的液體渦流排放（圖1c），與液體渦流表面接觸的分析物在幾秒鐘內(nèi)被捕獲、提取并輸送到質(zhì)譜儀的電離源。隨后，使用電噴霧電離（ESI）、大氣壓化學(xué)電離（APCI）或幾乎任何基于液體的電離源對(duì)分析物進(jìn)行電離，并通過(guò)MS進(jìn)行檢測(cè)。在該配置中，含有單個(gè)細(xì)胞的液滴朝著LVC探針落下，該探針位于液滴噴出部位的正下方（圖1b），液滴被液體渦流捕獲，其中細(xì)胞在暴露于溶劑（例如甲醇等）時(shí)，由于滲透壓的變化而破裂，細(xì)胞的內(nèi)容物在運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)譜儀的電離源（~6s），分析物分子被離子化，然后使用MS以非靶向（例如，飛行時(shí)間（TOF）-MS）或靶向（如，串聯(lián)MS）方式進(jìn)行測(cè)定。由于LVC探針是連續(xù)工作的，探針是自清潔的，去除了從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的信號(hào)攜帶，并且可以容易地確定溶劑離子或由介質(zhì)引起的離子的背景測(cè)定。這種方法的獨(dú)特之處在于，細(xì)胞一直保持在其“自然”狀態(tài)（在這種情況下是在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中），直到LVC-MS進(jìn)行裂解和化學(xué)分析。此外，SCP-LVC-MS技術(shù)不需要分子標(biāo)記或其他樣品制備方案，質(zhì)譜儀和電離源的操作方式與通常用于測(cè)定細(xì)胞群體中細(xì)胞化學(xué)的直接注入ESI實(shí)驗(yàn)的操作方式完全相同。

圖1：SCP-LVC-MS系統(tǒng)概述

為了評(píng)估SCP-LVC-MS系統(tǒng)測(cè)定單細(xì)胞化學(xué)圖譜的能力，作者使用了直徑約為5-15μm的CC-125野生型mt+[137c]ChRe微藻，在不稀釋或不對(duì)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行其他改變的情況下，將ChRe細(xì)胞懸浮液移液到SCP芯片中，放置在SCP分配器上，并調(diào)整液滴噴射設(shè)置，在1分鐘窗口內(nèi)對(duì)9個(gè)細(xì)胞取樣時(shí)的總離子色譜圖（TIC）如圖2a所示，TIC中的每個(gè)信號(hào)尖峰對(duì)應(yīng)于單個(gè)細(xì)胞的分析。該過(guò)程僅允許包含單個(gè)細(xì)胞的液滴落入LVC-MS探針中，在t=0.55分鐘時(shí)，細(xì)胞液滴噴射前后的噴嘴圖像（用“*”表示圖2a）分別如圖2b和c所示。收集同一細(xì)胞的TOF-MS以及三次SWATH-MS掃描，在TOF-MS光譜中觀察到數(shù)十個(gè)離散離子（圖2d）。圖2e-g是基于單獨(dú)的串聯(lián)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)和SWATH-MS掃描結(jié)果，在同一細(xì)胞的SWATH-MS質(zhì)譜中可以觀察到相關(guān)分子的特征碎片離子。

圖2.ChRe微藻單細(xì)胞的SCP-LVC-MS分析

除此之外，SCP-LVC-MS技術(shù)也在其他類型細(xì)胞上得到了驗(yàn)證，獲得了另外一種微藻EuGr以及HeLa細(xì)胞（源于宮頸癌癥的常用人類上皮細(xì)胞系）的單細(xì)胞質(zhì)譜。將細(xì)胞懸液直接從其培養(yǎng)基或儲(chǔ)存介質(zhì)（分別用于EuGr和HeLa細(xì)胞的HSM和磷酸鹽緩沖鹽水（PBS））移液到各自的SCP芯片中，并通過(guò)LVC探針進(jìn)行采樣。除了稀釋HeLa細(xì)胞懸浮液之外，在分析之前的任何一個(gè)實(shí)驗(yàn)中都沒(méi)有使用樣品制備（過(guò)濾、離心、固定等）。EuGr和HeLa實(shí)驗(yàn)的TIC軌跡分別如圖3a和3b所示。EuGr細(xì)胞直徑約20μm，呈橢圓形（圖3d），細(xì)胞的活性突出表明，它們從自然狀態(tài)一直到LVC探針捕獲點(diǎn)都沒(méi)有受到干擾，EuGr細(xì)胞的TOF-MS光譜如圖3g所示。單個(gè)HeLa細(xì)胞（直徑約15μm）的圖像和質(zhì)譜分別如圖3f和3h所示。

圖3.Euglena gracilis和HeLa細(xì)胞的單細(xì)胞分析

這些數(shù)據(jù)共同突出了SCP-LVC-MS系統(tǒng)測(cè)定藻類和哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型的單細(xì)胞化學(xué)的能力。該過(guò)程除了稀釋之外沒(méi)有采取額外樣品制備措施，通過(guò)對(duì)每種培養(yǎng)基的空液滴進(jìn)行采樣評(píng)估，發(fā)現(xiàn)幾乎沒(méi)有產(chǎn)生細(xì)胞中測(cè)定到的脂質(zhì)信號(hào)，這表明脂質(zhì)信號(hào)來(lái)自LVC探針中裂解的細(xì)胞，也表明用于稀釋的培養(yǎng)基在該m/z范圍（700-1000）內(nèi)對(duì)單細(xì)胞質(zhì)譜的影響通常可以忽略不計(jì)。

SCP-LVC-MS系統(tǒng)的獨(dú)特之處在于，相對(duì)于其他非靶向MS單細(xì)胞方法，能夠以高采樣吞吐量以非靶向方式測(cè)定單細(xì)胞。SCP-LVC-MS系統(tǒng)的可行性通過(guò)測(cè)定微藻及HeLa細(xì)胞在其天然生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的脂質(zhì)組成被驗(yàn)證。在單個(gè)細(xì)胞中觀察到大量的二酰基甘油基三甲基高絲氨酸（DGTS）、磷脂酰膽堿（PC）、單半乳糖基二�；�甘油（MGDG）和二半乳糖基甘油（DGDG）脂質(zhì)。該文還進(jìn)行了其他實(shí)驗(yàn)以證實(shí)不同單細(xì)胞脂質(zhì)存在明顯差異以及以單細(xì)胞分辨率解決細(xì)胞群體差異的能力。

綜上，本文獻(xiàn)報(bào)告了一種方法，該方法通過(guò)單細(xì)胞打印機(jī)技術(shù)和液體渦流捕獲質(zhì)譜法（SCP-LVC-MS）的結(jié)合，無(wú)需額外的樣品制備程序（如分子標(biāo)記），即可對(duì)細(xì)胞懸浮液中的單細(xì)胞進(jìn)行無(wú)靶向、高通量和定量質(zhì)譜分析。

Cahill JF, Riba J, Kertesz V. Rapid, Untargeted Chemical Profiling of Single Cells in Their Native Environment. Anal Chem. 2019 May 7;91(9):6118-6126. doi: 10.1021/acs.analchem.9b00680. Epub 2019 Apr 19. PMID: 30955322.