表觀遺傳修飾包括有絲分裂遺傳和穩(wěn)定的修飾，這些修飾在不改變基礎(chǔ)DNA序列的情況下調(diào)控基因表達。通常癌癥中的表觀遺傳失調(diào)表現(xiàn)為突變、表觀遺傳修飾酶異常表達以及相關(guān)輔因子水平變化。其中5-甲基胞嘧啶（m5C）是一種普遍存在的RNA修飾，參與RNA代謝調(diào)控和多種腫瘤發(fā)生過程。結(jié)直腸癌（CRC）是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，全球范圍內(nèi)第三大最常見的惡性腫瘤。主要的治療方法包括手術(shù)、化療和放療，但CRC患者預后仍然不佳，轉(zhuǎn)移性CRC的5年生存率僅為13.1%。越來越多的研究證實m5C修飾與包括膀胱癌（BLCA）、食管癌（ESCA）、胃腺癌（STAD）和肝細胞癌（LIHC）在內(nèi)的多種癌癥的致癌和腫瘤發(fā)生之間的復雜關(guān)系。然而，m5C修飾是否可能有助于促進CRC進展仍未充分闡明。

2024年5月20日，武漢大學中南醫(yī)院江從慶教授/ Jianhong Zhao/任相海/解蕭宇共同通訊在著名OA期刊《Advanced Science》發(fā)表題為“Metabolic Recoding of NSUN2-Mediated m5C Modification Promotes the Progression of Colorectal Cancer via the NSUN2/YBX1/m5C-ENO1 Positive Feedback Loop”的研究論文。研究通過RNA-Bis-seq等分析鑒定出m5C甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2在CRC中表達水平升高及其在CRC中的致癌作用，以及潛在的遺傳和分子機制。NSUN2誘導的代謝重編程以m5C依賴性方式調(diào)控ENO1表達增強葡萄糖代謝，導致CRC細胞中乳酸產(chǎn)生增加。此外，乳酸不僅通過組蛋白H3K18乳酸化（H3K18la）激活NSUN2轉(zhuǎn)錄，還誘導NSUN2在Lys356殘基（K356）發(fā)生乳酸化，這對于捕獲靶RNA和ENO1 mRNA m5C修飾至關(guān)重要。研究還鑒定出一種有效的NSUN2小分子抑制劑，可降低酶的功能和下游標靶表達，為CRC免疫治療提供了一種新穎且有希望的治療選擇�？傊�，本研究揭示了一個NSUN2/YBX1/m5C-ENO1信號軸的正反饋回路（Positive Feedback Loop），從而連接了代謝重編程和表觀遺傳重塑之間的聯(lián)系。易基因科技為本研究提供m5C甲基化修飾的RNA-Bis-seq技術(shù)服務(wù)。
 
標題：Metabolic Recoding of NSUN2-Mediated m5C Modification Promotes the Progression of Colorectal Cancer via the NSUN2/YBX1/m5C-ENO1 Positive Feedback Loop（NSUN2介導的m5C修飾的代謝重新編碼通過NSUN2/YBX1/m5C-ENO1正反饋回路促進結(jié)直腸癌進展）
時間：2024.5.20
期刊：《先進科學》（Advanced Science）（中科院1區(qū)Top期刊，影響因子15.1）
實驗方法： IP 和 Western blotting、mRNA BS-seq、RNA-seq、PAR-CLIP、熒光素酶報告基因檢測等
 
研究摘要：
5-甲基胞嘧啶（m5C） RNA修飾，最近作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控因子而受到關(guān)注，與多種腫瘤形成過程密切相關(guān)。然而，m5C修飾在結(jié)直腸癌（CRC）發(fā)生和進展過程中的確切機制仍不清楚。本研究鑒定出CRC中m5C甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2表達顯著升高，并發(fā)揮致癌作用。從機制上講，NSUN2和YBX1被鑒定為ENO1的識別蛋白“writers”和閱讀蛋白“readers”，最終以m5C依賴性方式重編程葡萄糖代謝，并增加乳酸產(chǎn)生。而CRC細胞的乳酸積累通過組蛋白H3K18乳酸化（H3K18la）激活NSUN2轉(zhuǎn)錄，并誘導NSUN2在Lys356殘基（K356）發(fā)生乳酸化。這些結(jié)果共同揭示了一個參與NSUN2/YBX1/m5C-ENO1信號軸的正反饋回路，從而連接了代謝重編程和表觀遺傳重塑之間的聯(lián)系，可能為將NSUN2抑制劑與免疫療法相結(jié)合治療CRC的治療潛力提供線索。
 
結(jié)果圖形：
（1）CRC中m5C水平升高和NSUN2表達增加
圖1：結(jié)直腸癌（CRC）中m5C水平和NSUN2上調(diào)，并與CRC進展和轉(zhuǎn)移相關(guān)。
A. TCGA數(shù)據(jù)庫中癌癥和正常組織的m5C相對水平比較分析。
B. CRC患者中m5C的代表性免疫組化染色（左）和定量分析（右）。
C. TCGA數(shù)據(jù)庫中癌癥和正常組織的18個m5C調(diào)控基因相對表達比較分析。
D. 在獨立的配對CRC患者隊列中，對18個m5C調(diào)控基因的倍數(shù)變化和P值進行等級排序分析。
E. NSUN2蛋白在對照結(jié)腸組織（Ctrl）和經(jīng)AOM/DSS誘導的CRC小鼠或APCMin/+/DSS誘導的CRC小鼠（APCMin/+/DSS）腫瘤組織中的表達。
F. CRC隊列中臨床病理因素與NSUN2蛋白表達之間的關(guān)聯(lián)餅圖。

（2）NSUN2的缺失抑制了CRC腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移
圖2：NSUN2缺失在體外和體內(nèi)抑制CRC的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。
A. SW480和HT29細胞中transwell實驗的代表性圖像（左）以及隨附的條形圖顯示了HT29細胞的相對侵襲數(shù)（右）。
B. NSUN2敲除或?qū)φ盏腍T29和SW480細胞的代表性集落形成結(jié)果（左），以及隨附的條形圖顯示了HT29細胞的相對集落數(shù)（右）。
C. NSUN2敲除或?qū)φ盏腃RC細胞的腫瘤球體形成實驗的代表性圖像。
D. NSUN2敲除組和對照組小鼠皮下腫瘤的代表性圖片。
E. 通過對照或NSUN2敲除CRC細胞形成的皮下腫瘤生長曲線。
F. 對照組或NSUN2敲除組形成的皮下腫瘤重量。
G. 小鼠尾靜脈注射對照或NSUN2敲除CRC細胞后肺轉(zhuǎn)移的代表性生物發(fā)光和HE染色圖像。
H. 對照組或NSUN2基因敲除組的肺轉(zhuǎn)移數(shù)量和肺重量統(tǒng)計分析。
I. CRC脾內(nèi)肝轉(zhuǎn)移小鼠模型示意圖。
J. 脾臟遠端注射對照或NSUN2敲除CRC細胞后小鼠肝轉(zhuǎn)移的代表性生物發(fā)光和HE染色圖像。
K. AOM/DSS誘導的原位CRC小鼠模型示意圖。
L. 在AOM/DSS誘導的原位CRC模型中，Nsun2+/+和Nsun2-/-小鼠的體重曲線。
M. Nsun2+/+和Nsun2-/-小鼠在AOM/DSS誘導的原位CRC模型中的存活曲線。
N. AOM/DSS誘導的原位CRC模型中Nsun2+/+和Nsun2-/-小鼠的結(jié)腸腫瘤代表性圖像。
O. Nsun2+/+和Nsun2-/-組小鼠結(jié)腸直腸腫瘤總數(shù)比較分析。
P. Nsun2+/+和Nsun2-/-組小鼠結(jié)腸直腸腫瘤數(shù)量指示大小比較分析。
 
（3）NSUN2介導的m5C 修飾通過靶向 CRC 中的 ENO1 導致葡萄糖代謝重編程
NSUN2是一種重要的m5C甲基轉(zhuǎn)移酶，作者分析了NSUN2如何以m5C依賴性方式參與結(jié)直腸癌（CRC）的發(fā)生和進展。對NSUN2基因敲除（KO）和對照CRC細胞進行了RNA測序（RNA-Seq）和RNA亞硫酸鹽測序（RNA-BiS-Seq）（圖3A）�？偣餐ㄟ^RNA-Seq鑒定了829個差異表達基因（DEGs），包括482個下調(diào)基因和347個上調(diào)基因（圖3B）�；�因本體（GO）分析顯示，這些DEGs富集在與葡萄糖代謝相關(guān)通路中，包括經(jīng)典的糖酵解、葡萄糖至丙酮酸分解過程、通過果糖-6-磷酸的糖酵解過程、NADH再生和葡萄糖分解過程（圖3C）。KEGG分析顯示，NSUN2缺失影響了CRC細胞中的碳代謝（中心碳代謝）和糖酵解。與這些發(fā)現(xiàn)一致，NSUN2基因敲除降低了SW480和HT29細胞中的葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生，并同時抑制了細胞外酸化率（ECAR）（圖3D、E）。接著，研究了NSUN2缺失如何減弱CRC細胞中的糖酵解代謝。RNA-BiS-Seq分析顯示，在NSUN2基因敲除組中，不同染色體和基因區(qū)域的甲基化水平顯著降低（圖3F）。RNA-BiS-Seq和RNA-Seq的綜合分析表明，與對照組相比，NSUN2基因敲除CRC細胞中ENO1的m5C甲基化和mRNA水平顯著降低（圖3G）。研究人員分析了NSUN2介導的m5C修飾對ENO1的影響。RT-qPCR分析和Western Blot分析結(jié)果表明，NSUN2敲低和基因敲除顯著降低了CRC細胞中ENO1 mRNA（圖3H）和蛋白水平（圖3I），而NSUN2過表達則結(jié)果相反（圖3H、I）。使用ENO1特異性引物的亞硫酸鹽PCR測序（BSP）結(jié)果表明，在NSUN2缺失的CRC細胞中，ENO1位點甲基化沉默（圖3J）。在TCGA數(shù)據(jù)分析中，NSUN2的RNA表達與CRC中ENO1水平呈顯著正相關(guān)（圖3K）。為了進一步驗證NSUN2在調(diào)控ENO1的致癌功能是否依賴于m5C甲基轉(zhuǎn)移酶活性，通過在釋放位點（半胱氨酸271）或催化位點（半胱氨酸321）引入點突變，構(gòu)建了兩個非功能性NSUN2突變體，目的是破壞其m5C酶活性。結(jié)果表明，確實只有野生型（WT）NSUN2過表達才能在NSUN2KO CRC細胞中恢復ENO1 mRNA（圖3L）和蛋白水平（圖3M）。NSUN2介導的m5C修飾可能通過增加mRNA穩(wěn)定性來維持ENO1表達。如圖3N,O所示，在NSUN2KO細胞中，ENO1 RNA的半衰期在使用放線菌素D處理后顯著降低，而NSUN2WT過表達逆轉(zhuǎn)了這種降低，但NSUN2C271A或NSUN2C321A突變體則沒有。同樣的，在AOM/DSS誘導的Nsun2+/+小鼠中觀察到的組織學異常中ENO1的水平也高于Nsun2-/-小鼠（圖3P）。在體外拯救實驗中，ENO1過表達逆轉(zhuǎn)了NSUN2基因敲除CRC細胞中的增殖和侵襲能力下降，以及葡萄糖代謝的下降（圖3Q）。但在體內(nèi)實驗中，ENO1基因敲除背景下NSUN2過表達未能有效恢復降低的皮下植入CRC腫瘤，表明ENO1可能是NSUN2的一個關(guān)鍵下游靶標（圖3R–T）。所有這些發(fā)現(xiàn)證明了ENO1在NSUN2介導的m5C修飾中的關(guān)鍵作用，有助于CRC中葡萄糖代謝的重編程。
圖3：NSUN2介導的m5C修飾通過靶向CRC中的ENO1導致葡萄糖代謝重編程。
A. CRC細胞中RNA-Seq和RNA-BiS-Seq過程插圖。
B. 對照組和NSUN2基因敲除組的基因表達差異熱圖。
C. 對照組和NSUN2基因敲除CRC細胞組差異表達基因的GO分析。
D. 對照組和NSUN2基因敲除SW480細胞之間相對葡萄糖攝取和乳酸產(chǎn)生比較。
E. 對照組和NSUN2基因敲除SW480細胞的ECAR分析。
F. 對照組和NSUN2基因敲除組的不同基因組區(qū)域平均甲基化水平比較。
G. RNA-Seq和RNA-BiS-Seq綜合分析鑒定基因表達和m5C甲基化水平上顯著變化的mRNAs分布。
H-I.  指定載體處理后CRC細胞中ENO1的mRNA和蛋白表達水平分析。
J. Sanger分析對照和NSUN2基因敲除CRC細胞ENO1 RNA中的m5C位點。
K. TCGA-CRC數(shù)據(jù)庫中ENO1和NSUN2相對mRNA表達水平的相關(guān)性分析。
L-M. 指定載體處理后CRC細胞中ENO1的相對mRNA和蛋白表達水平。
N-O.  SW480和HT29細胞經(jīng)指定載體處理后ENO1 mRNA半衰期分析。
P. 在AOM/DSS誘導的CRC模型中，Nsun2+/+和Nsun2-/-小鼠腫瘤組織中NSUN2和ENO1蛋白表達水平。
Q. 在NSUN2基因敲除CRC細胞中ENO1過表達后乳酸產(chǎn)生的拯救實驗。
R. 荷瘤小鼠體內(nèi)拯救模型（每組n=5只小鼠）的解剖皮下腫瘤圖像。
S. 每4天檢測一次的荷瘤小鼠皮下腫瘤體積的時間進程評估。
T. 指定組別皮下腫瘤最終重量散點圖。

（4）YBX1作為m5C reader識別和穩(wěn)定ENO1 圖4：YBX1作為m5C reader，識別和穩(wěn)定ENO1 mRNA。
A. CRC細胞中RNA下拉和質(zhì)譜分析過程插圖。
B. 使用SDS/PAGE隨后用銀染法對Input和RNA下拉蛋白質(zhì)進行分析。
C. 質(zhì)譜分析后，從RNA下拉獲得的潛在ENO1[m5C]結(jié)合蛋白進行Western blotting分析。
D. CRC細胞中YBX1與ENO1結(jié)合能力的PAR-CLIP-qPCR分析。
E. YBX1 CSD和ENO1 m5C RNA寡聚物復合物表面靜電電勢。YBX1 CSD結(jié)構(gòu)域?qū)�m5C的識別。
F. 通過MST定量分析未修飾或m5C修飾的ENO1 RNA低聚物與YBX1-CSD的結(jié)合親和力。
G. TCGA-CRC數(shù)據(jù)庫中ENO1和YBX1相對mRNA表達水平的相關(guān)性分析。
H. NSUN2敲低或基因敲除的CRC細胞中YBX1蛋白水平的Western blotting分析。
I. 在NSUN2敲低的SW480細胞中YBX1與ENO1 RNA結(jié)合能力的PAR-CLIP-qPCR分析。
J. 在NSUN2敲低的HT29細胞中YBX1與ENO1 RNA結(jié)合能力的PAR-CLIP-qPCR分析。
K. YBX1在SW480細胞中與ENO1 RNA結(jié)合能力的PAR-CLIP-qPCR分析。
L. YBX1敲低的CRC細胞中ENO1 mRNA相對表達水平的RT-qPCR分析。
M. YBX1敲低的CRC細胞中ENO1蛋白相對表達水平的Western blotting分析。
N. YBX1敲低SW480細胞ENO1 mRNA的RNA半衰期分析。
O. NSUN2基因敲除的SW480和HT29細胞中，通過HA-YBX1下拉的RNA的PAR-CLIP分析。
P. 在NSUN2基因敲除并轉(zhuǎn)染Flag-EV、Flag-NSUN2WT或Flag-NSUN2DM的SW480細胞中，由HA-YBX1敲低的RNA的Rescue PAR-CLIP分析。
Q. 在對照或穩(wěn)定的YBX1過表達SW480細胞中野生型ENO1-m5C位點（ENO1WT）或突變m5C位點（ENO1MUT）的熒光素酶報告基因分析。
R. 在對照或穩(wěn)定的YBX1過表達HT29細胞中ENO1WT或ENO1MUT的熒光素酶報告基因分析。

（5）腫瘤源性乳酸通過組蛋白乳�；�誘導NSUN2表達上調(diào)
圖5：腫瘤源性乳酸通過組蛋白H3K18乳酸化激活NSUN2轉(zhuǎn)錄，并直接誘導K356位點的NSUN2乳酸化。
A. 說明ENO1在葡萄糖代謝中功能作用的代謝流程圖。
B. 對經(jīng)25 mM L-乳酸處理指定時間的CRC細胞全細胞裂解液中指定蛋白的Western blotting分析。
C. 經(jīng)si-NC或si-LDHA或si-LDHB或2-DG處理的CRC細胞中NSUN2和ENO1蛋白水平的Western blotting分析。
D. 在TCGA-CRC數(shù)據(jù)庫中，NSUN2與MCT1相對mRNA表達水平的相關(guān)性分析。
E. 對添加25 mM L-乳酸的CRC細胞全細胞裂解液中指定蛋白水平的Western blotting分析。
F. 對經(jīng)25 mM L-乳酸處理24小時或經(jīng)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300抑制劑(C646或A485)處理24小時的CRC細胞全細胞裂解液中指定蛋白的Western blotting分析。
G. 對經(jīng)25 mM L-乳酸或500 nM rotenone處理24小時的CRC細胞中NSUN2相對于Input水平進行ChIP-qPCR分析。
H. ENO1敲低CRC細胞全細胞裂解液中指定蛋白的Western blotting分析。
I. 說明NSUN2通過ENO1調(diào)控促進NSUN2轉(zhuǎn)錄形成正反饋回路圖表。
J. 用于預測NSUN2和L-乳酸分子之間結(jié)合親和力的分子對接。
L.  對經(jīng)25 mM L-乳酸處理或未處理24小時的CRC細胞核和細胞質(zhì)部分中NSUN2相對表達的Western blotting分析。
M.  對經(jīng)25 mM L-乳酸處理或未處理24小時的SW480細胞中NSUN2蛋白的免疫熒光分析。
N. 對經(jīng)指定載體和L-乳酸處理并在UV交聯(lián)后的CRC細胞中指定目標的免疫沉淀和Western blotting分析。
O. 對不同處理的CRC細胞中相對RNA表達水平的RT-qPCR分析。
 
（6）NSUN2小分子高效抑制劑與免疫療法聯(lián)合應用鑒定 A. 從ChemDIV數(shù)據(jù)庫中鑒定NSUN2抑制劑的金字塔流程圖。
B. 基于NSUN2晶體結(jié)構(gòu)的活性口袋和2091804種化合物開發(fā)了對接模型。
C. 前5種抑制劑在NSUN2蛋白催化中心的對接姿態(tài)（左）。這5種小分子抑制劑的2D結(jié)構(gòu)（右）。
D. 使用小分子抑制劑Nsun2-i4處理后的CRC細胞的CCK8分析。
E. Nsun2-i4抑制劑與NSUN2蛋白之間互作的MST分析。
F. 在SW480和HT29細胞系中暴露于15 μM Nsun2-i4 12小時后的指定蛋白的Western blotting分析。
G. 小分子抑制劑（Nsun2-i4）在C57BL/6N小鼠中的給藥示意圖（左）。經(jīng)Nsun2-i4處理的小鼠模型的肝臟、脾臟、腎臟和結(jié)腸的HE染色（右）。
H. AOM/DSS誘導的正位小鼠模型中NSUN2小分子抑制劑（Nsun2-i4）的示意圖。
I. 在AOM/DSS誘導的原位CRC模型中，對照組和Nsun2-i4處理組小鼠的結(jié)腸腫瘤典型圖像（左）。對照組和Nsun2-i4組小鼠結(jié)腸腫瘤總數(shù)比較（中）。對照組和Nsun2-i4組小鼠指定大小的結(jié)腸腫瘤數(shù)量比較（右）。
J. 小分子抑制劑（Nsun2-i4）和PD-1在同源C57BL/6N小鼠中的聯(lián)合療法效果示意圖。
K. 在同源C57BL/6N模型結(jié)束時，來自荷瘤小鼠的皮下腫瘤的解剖圖像（每組n=5只小鼠）。
L. 在C57BL/6N小鼠中每4天測量一次的皮下腫瘤體積的時間進程評估。
M. 指定組別皮下腫瘤最終重量散點圖。

（7）NSUN2和ENO1與CRC患者葡萄糖代謝相關(guān)
圖7：NSUN2和ENO1與結(jié)直腸癌（CRC）患者的葡萄糖代謝相關(guān)。
A. 臨床CRC患者組織與PET-CT結(jié)果整合及葡萄糖代謝分析示意圖。
B. CRC患者基于PET-CT SUVmax值的葡萄糖代謝的排名表。
C. CRC患者高葡萄糖代謝組和低葡萄糖代謝組的代表性PET-CT圖像。
D. 在高代謝和低代謝組中NSUN2（左）和ENO1（右）的相對RNA表達水平。
E. NSUN2相對RNA表達水平與腫瘤SUVmax（左）的相關(guān)性分析。ENO1相對RNA表達水平與腫瘤SUVmax（中）的相關(guān)性分析。CRC患者中NSUN2與ENO1相對RNA表達水平（右）的相關(guān)性分析。
F. 本研究提出的關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)的示意圖總結(jié)。

研究總結(jié)：
本研究揭示了一個非常有趣的正反饋回路，在該回路中，NSUN2促進并穩(wěn)定ENO1 mRNA，然后增強糖酵解并增加由于ENO1上調(diào)而產(chǎn)生的乳酸，回過來又刺激NSUN2轉(zhuǎn)錄。因此，靶向NSUN2可能破壞這一正反饋回路。最近研究進展表明，乳酸作為調(diào)節(jié)性T細胞（Treg細胞）的代謝檢查點，并通過上調(diào)PD-1表達調(diào)控腫瘤微環(huán)境中的免疫反應。此外，研究鑒定了NSUN2激活維持了整體m5C RNA甲基化，并穩(wěn)定TREX2以限制細胞質(zhì)dsDNA積累和cGAS/STING激活，最終促進腫瘤發(fā)生和對anti-PD-L1免疫療法的抗性。為了提高這項研究的潛在臨床適用性，本研究使用基于分子對接的虛擬篩選從ChemDIV數(shù)據(jù)庫中篩選出NSUN2的小分子抑制劑，并確定Nsun2i-4為一種在體內(nèi)無明顯毒性的有效抑制劑。采用CRC同源小鼠模型進一步評估NSUN2抑制劑與PD-1阻斷聯(lián)合的療效，令人鼓舞的結(jié)果支持了NSUN2在CRC癌癥免疫療法中的潛力。最終，通過使用PET-CT和TCGA數(shù)據(jù)庫的大規(guī)�；�因組測序數(shù)據(jù)對獨立的臨床CRC隊列進行分析，驗證了這一調(diào)控軸的可靠性。獨立臨床隊列結(jié)果和TCGA數(shù)據(jù)分析進一步證實了高葡萄糖代謝組中NSUN2和ENO1表達水平升高。與TCGA-CRC隊列中糖酵解低/NUN2低/ENO1低特征的患者相比，糖酵解高/NSUN2高/ENO1高特征的患者分別顯示出顯著的生存益處。

總之，本研究專注NSUN2/YBX1/m5C-ENO1信號軸的大量工作可能為結(jié)直腸癌的發(fā)病機制和表觀遺傳-免疫靶標的鑒定提供有價值的見解。

參考文獻：
Chen B, Deng Y, Hong Y, Fan L, Zhai X, Hu H, Yin S, Chen Q, Xie X, Ren X, Zhao J, Jiang C. Metabolic Recoding of NSUN2-Mediated m5C Modification Promotes the Progression of Colorectal Cancer via the NSUN2/YBX1/m5C-ENO1 Positive Feedback Loop. Adv Sci (Weinh). 2024 May 20:e2309840. doi: 10.1002/advs.202309840. PubMed PMID: 38769664.