共價(jià)抑制劑最早可追溯到 17 世紀(jì)末的非甾體抗炎藥 Aspirin (阿司匹林)。相較于非共價(jià)藥物，共價(jià)藥物的優(yōu)勢(shì)在于能夠提高藥物效力，延長(zhǎng)靶向結(jié)合時(shí)間，選擇性更強(qiáng)，同時(shí)可以靶向某些“不可成藥” 靶點(diǎn)，解決耐藥性問(wèn)題。

越來(lái)越多的研究表明，許多已上市的藥物都是通過(guò)共價(jià)作用發(fā)揮其藥效，近年來(lái)一些共價(jià)蛋白激酶抑制劑的成功上市，如 Ibrutinib  (BTK 共價(jià)抑制劑) 和 Dacomitinib  (EGFR 共價(jià)抑制劑)，更是讓共價(jià)藥物成為了藥物開(kāi)發(fā)中一個(gè)備受關(guān)注的領(lǐng)域[1]。

圖 1. 共價(jià)藥物的開(kāi)發(fā)歷程^[1]。 

在過(guò)去的共價(jià)藥物的研究歷史中，共價(jià)藥物主要是來(lái)源自偶然發(fā)現(xiàn)。盡管最早的共價(jià)藥物阿司匹林上市于 1899 年，但直到 1971 年阿司匹林的共價(jià)作用機(jī)制才被揭開(kāi)。

阿司匹林中的活性成分乙酰水楊酸共價(jià)結(jié)合環(huán)氧合酶 (COX-1 和 COX-2)，將其乙�；�轉(zhuǎn)移到 COX 的絲氨酸側(cè)鏈的羥基上，抑制花生四烯酸（環(huán)氧合酶的底物）轉(zhuǎn)化為前列腺素，以發(fā)揮抗炎作用。青霉素類抗生素是另一類共價(jià)抑制劑，后面被發(fā)現(xiàn)其機(jī)制是基于青霉素 β-內(nèi)酰胺類化合物與青霉素結(jié)合蛋白 1B 的活性位點(diǎn)絲氨酸共價(jià)結(jié)合[2]。


圖 2. (a-c) 阿司匹林和 (d-e) 青霉素的共價(jià)作用機(jī)制圖^[2]。

由此可見(jiàn)，之前的共價(jià)藥物都不是刻意設(shè)計(jì)的，大多數(shù)來(lái)自于天然產(chǎn)物，其共價(jià)機(jī)制更是在臨床上被廣泛使用后才被闡明。由于共價(jià)化合物在過(guò)去被認(rèn)為可能帶來(lái)脫靶效應(yīng)，并且誘發(fā)一些免疫反應(yīng)從而存在潛在的安全問(wèn)題，因此當(dāng)時(shí)大多數(shù)醫(yī)藥公司都會(huì)優(yōu)先考慮非共價(jià)化合物，直到后期越來(lái)越多藥物的共價(jià)機(jī)制被披露，共價(jià)化合物才開(kāi)始被藥物開(kāi)發(fā)人員重視起來(lái)。迄今為止，共價(jià)抑制劑更是占據(jù)了上市藥物約 30% 的比例。

傳統(tǒng)的小分子藥物設(shè)計(jì)是基于抑制或激活生物靶標(biāo)的生物活性從而發(fā)揮作用。無(wú)論小分子藥物的功能如何，其作用通常取決于活性物質(zhì) (如抑制劑、效應(yīng)劑或激活劑) 與生物靶標(biāo) (如酶、蛋白質(zhì)、離子通道或受體) 之間的相互作用。
 Tips：
共價(jià)藥物與靶標(biāo)發(fā)生共價(jià)結(jié)合主要分為兩個(gè)過(guò)程：(1) 共價(jià)藥物的親電彈頭通過(guò)靠近生物靶標(biāo)的活性氨基酸殘基，與生物靶標(biāo)可逆性結(jié)合。(2) 共價(jià)藥物與生物靶標(biāo)發(fā)生反應(yīng)以形成共價(jià)鍵。

根據(jù)反應(yīng)的可逆性，共價(jià)藥物可以被分為可逆型共價(jià)藥物和不可逆型共價(jià)藥物。可逆性共價(jià)藥物在設(shè)計(jì)上旨在提高藥物的安全性和選擇性，而不可逆性共價(jià)藥物則提供了更持久的藥理作用，但需要更仔細(xì)地考慮其潛在的脫靶效應(yīng)和毒性風(fēng)險(xiǎn)，建議大家謹(jǐn)慎選擇哦~

丙烯酰胺、β-內(nèi)酰胺等親電彈頭是共價(jià)藥物發(fā)揮作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，親電彈頭能與靶蛋白中特定的氨基酸殘基 (如半胱氨酸、絲氨酸或蘇氨酸等) 發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成共價(jià)鍵，從而抑制靶標(biāo)蛋白的生物學(xué)功能。目前為止，已有幾十種的親電彈頭被發(fā)現(xiàn)，其中在上市和待批準(zhǔn)藥物中以“丙烯酰胺類彈頭”開(kāi)發(fā)的共價(jià)藥物數(shù)量最多[3]。

生物靶點(diǎn)的識(shí)別和驗(yàn)證是藥物發(fā)現(xiàn)的第一步，接下來(lái)是對(duì)鑒定出的苗頭化合物進(jìn)行表征和結(jié)構(gòu)優(yōu)化。共價(jià)藥物發(fā)現(xiàn)中使用的許多方法與傳統(tǒng)藥物化學(xué)中使用的方法相似，包括高通量篩選、虛擬篩選和合理的藥物設(shè)計(jì)等。然而，在共價(jià)藥物的設(shè)計(jì)中，很多地方都是獨(dú)一無(wú)二的 (如靶點(diǎn)選擇、親電彈頭和氨基酸殘基的選擇等)。因此，共價(jià)藥物的設(shè)計(jì)一般包含四個(gè)過(guò)程：靶標(biāo)識(shí)別和氨基酸殘基選擇；苗頭化合物的識(shí)別；結(jié)合表征；結(jié)構(gòu)優(yōu)化[4]。

圖 3. 共價(jià)藥物設(shè)計(jì)的階段圖^[4]。 
▐  靶標(biāo)識(shí)別及氨基酸殘基的選擇
治療靶標(biāo)的識(shí)別是共價(jià)藥物設(shè)計(jì)的第一步，往往基于遺傳學(xué)、生物物理學(xué)、化學(xué)物理學(xué)或其他原理的方法進(jìn)行。通常，疾病靶點(diǎn)應(yīng)當(dāng)作為藥物設(shè)計(jì)的第一指導(dǎo)原則，在開(kāi)展藥物開(kāi)發(fā)工作前，確認(rèn)疾病-靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)度非常重要。
目前，基于活性的蛋白質(zhì)分析 (Activity-based protein profiling, ABPP) 是用于共價(jià)化合物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)最通用的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法之一，通過(guò)反應(yīng)性共價(jià)片段來(lái)確定共價(jià)作用的可能靶點(diǎn)。初步篩選出可能的靶點(diǎn)后，還需要對(duì)藥物靶標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證，目的是通過(guò)調(diào)節(jié)靶標(biāo)來(lái)驗(yàn)證其對(duì)疾病的治療作用，為靶點(diǎn)的“二次鑒定”提供依據(jù)。

在共價(jià)藥物的設(shè)計(jì)中，氨基酸殘基的選擇同樣尤為重要。在設(shè)計(jì)共價(jià)藥物時(shí)必須考慮共價(jià)彈頭和氨基酸殘基的反應(yīng)性。此外，還需要考慮該生物靶點(diǎn)是否適合共價(jià)機(jī)制，以避免潛在的藥物毒性，同時(shí)還需要滿足藥物的高選擇性。在各類氨基酸殘基中，半胱氨酸是最為常見(jiàn)的共價(jià)氨基酸殘基，其代表藥物有奧美拉唑、氯吡格雷、阿法替尼等[5]。

圖 4. 常見(jiàn)的共價(jià)氨基酸殘基結(jié)構(gòu)^[4]。
▐  苗頭化合物的識(shí)別
高通量篩選 (High-throughput screen，HTS) 是藥物設(shè)計(jì)中常用技術(shù)之一，用于從化合物庫(kù)中發(fā)現(xiàn)可能成為藥物化學(xué)優(yōu)化的先導(dǎo)化合物，可以加速大批量化合物的篩選進(jìn)程。對(duì)于已知共價(jià)抑制劑及具有共價(jià)反應(yīng)基團(tuán)的活性小分子化合物，可以直接使用 HTS 對(duì)其進(jìn)行藥物篩選。

在共價(jià)藥物設(shè)計(jì)中，基于片段的藥物發(fā)現(xiàn) (Fragment-based Drug Discovery，F(xiàn)BDD) 是一種較為廣泛應(yīng)用的方法。FBDD 適用于篩選分子量更小、結(jié)構(gòu)不太復(fù)雜的分子，通過(guò)篩選出有活性的片段后，將不同片段進(jìn)行組合延伸以到新的藥物分子。由于片段化合物庫(kù)范圍更廣，因此篩選出活性化合物的概率更大。并且片段具有分子量小、無(wú)效基團(tuán)少的特點(diǎn)，后期更有利于進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化[6]。例如 BTK 抑制劑 TAK-020  (一種臨床前候選藥物) 就是基于 FBDD 發(fā)現(xiàn)的[7]。

圖 5. 基于 FBDD 的臨床候選藥物 TAK-020^[7]。

此外，DNA 編碼化合物庫(kù) (DNA Encoded compound Library，DEL) 技術(shù)也是一種共價(jià)藥物的篩選方法，與 HTS 和 FBDD 相比，DEL 最顯著的優(yōu)勢(shì)在于能夠篩選更大的文庫(kù)，可達(dá)到千萬(wàn)甚至數(shù)十億級(jí)別的數(shù)量[8]。在 2020 年的疫情期間，Rui Ge 等就基于 DEL 技術(shù)，構(gòu)建了具有 6 億個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)的 DNA 編碼文庫(kù)，針對(duì)冠狀病毒中的半胱氨酸蛋白酶 Mpro 進(jìn)行了共價(jià)抑制劑的篩選[9]。

▐  結(jié)合表征
藥物的表征是藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中的關(guān)鍵步驟，傳統(tǒng)的表征參數(shù)包括解離常數(shù)、IC₅₀、EC₅₀ 等。而共價(jià)藥物的主要表征方法有：體外生物活性測(cè)定、質(zhì)譜分析、時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù) (TR-FRET)、表面等離子體共振 (SPR) 技術(shù)等。事實(shí)上，表征參數(shù)及表征方法的選擇不能一概而論，需要根據(jù)藥物的本身特性去進(jìn)行選擇。
▐  結(jié)構(gòu)優(yōu)化
在確定了苗頭化合物后，我們往往需要對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，目的是改善其藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，增強(qiáng)共價(jià)彈頭的選擇性，避免脫靶效應(yīng)，增強(qiáng)藥物的作用時(shí)間等。最終經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)優(yōu)化后，就可以得到先導(dǎo)化合物。 

在過(guò)去的十年中，共價(jià)藥物在新藥開(kāi)發(fā)領(lǐng)域取得了顯著進(jìn)展，這主要得益于對(duì)共價(jià)作用機(jī)制的深入理解以及藥物開(kāi)發(fā)技術(shù)的持續(xù)創(chuàng)新。為了加速共價(jià)藥物領(lǐng)域的發(fā)展，MCE 精心設(shè)計(jì)了多種化合物庫(kù)，如共價(jià)化合物庫(kù)、半胱氨酸靶向共價(jià)化合物、半胱氨酸靶向片段庫(kù)、DNA 編碼化合物庫(kù)等。這些化合物庫(kù)不僅能夠?yàn)楣矁r(jià)藥物的開(kāi)發(fā)提供一定幫助，也是研究共價(jià)作用機(jī)制的重要工具。

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