【Cell】Spatially coordinated heterochromatinization of long synaptic genes in fragile X syndrome

脆性X綜合征中長(zhǎng)突觸基因的空間協(xié)調(diào)異染色質(zhì)化

脆性X綜合征（FXS）是由FMR1基因5’UTR區(qū)中CGG短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）的擴(kuò)增引起的。在這類(lèi)重復(fù)擴(kuò)增疾病中，短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）的不穩(wěn)定性會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄沉默。對(duì)于FXS，CGG重復(fù)次數(shù)達(dá)突變長(zhǎng)度（mutation-length，ML）后，會(huì)通過(guò)局部DNA甲基化抑制FMR1基因表達(dá)。作者在FXS患者衍生的iPSC、iPSC衍生的神經(jīng)祖細(xì)胞、EBV轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞和具有突變長(zhǎng)度CGG擴(kuò)增的腦組織中，常染色體上發(fā)現(xiàn)了Mb級(jí)H3K9me3結(jié)構(gòu)域，并且X染色體上的FMR1基因也有同種結(jié)構(gòu)。H3K9me3結(jié)構(gòu)域通過(guò)染色體間相互作用連接，并分為染色體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域（topologically associated domain，簡(jiǎn)稱(chēng)TAD） 嚴(yán)重錯(cuò)誤折疊和成環(huán)，它們存在于S末期復(fù)制的長(zhǎng)突觸基因中，復(fù)制應(yīng)激誘導(dǎo)的斷裂雙鏈中，以及易發(fā)生逐步體細(xì)胞不穩(wěn)定性的STR中。將突變長(zhǎng)度（mutation-length，ML）CGG轉(zhuǎn)換成突變前長(zhǎng)度（premutation length， PL）的CRISPR工程，可逆轉(zhuǎn)X染色體和多個(gè)常染色體上的H3K9me3重折疊TADs區(qū)域，并恢復(fù)基因表達(dá)。H3K9me3結(jié)構(gòu)域也可以出現(xiàn)在正常長(zhǎng)度的iPSC中，這表明它們之間聯(lián)系不局限于FXS。研究結(jié)果揭示了易受不穩(wěn)定性影響的基因座之間的Mb級(jí)異染色質(zhì)化和反式相互作用。

該研究利用 Nanopore 納米孔測(cè)序、Mb級(jí) Hi-C、CRISPR 和單細(xì)胞 Oligopaint FISH 成像等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)脆性 X 染色體綜合征（FXS）患者的常染色體上也存在 CGG 域的 DNA 甲基化，提出空間協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄沉默模型，為 FXS 疾病的分子機(jī)制探究開(kāi)辟新方向。與正常情況對(duì)比，具有ML CGG擴(kuò)增的FXS患者衍生的細(xì)胞系和腦組織更容易在常染色體和X染色體上產(chǎn)生Mb級(jí)H3K9me3結(jié)構(gòu)域。H3K9me3結(jié)構(gòu)域在S期結(jié)束時(shí)復(fù)制，以反式相互作用，并產(chǎn)生TADs、亞TAD以及環(huán)等不同類(lèi)型嚴(yán)重Mb級(jí)錯(cuò)誤折疊。它們與長(zhǎng)突觸基因，復(fù)制應(yīng)激誘導(dǎo)的雙鏈斷裂，以及易受逐步體細(xì)胞不穩(wěn)定性影響的STR緊密相關(guān)。通過(guò)將ML CGG轉(zhuǎn)化為PM CGG，可以逆轉(zhuǎn)X染色體和多個(gè)常染色體上H3K9me3信號(hào)；此時(shí)TAD被重折疊，反式相互作用不受限制，基因表達(dá)恢復(fù)。研究結(jié)果揭示了BREACHes（beacons of repeat expansion anchoredby contacting heterochromatin，通過(guò)接觸異染色質(zhì)錨定的重復(fù)擴(kuò)增信標(biāo)）——連接Mb級(jí)H3K9me3結(jié)構(gòu)域、順式中嚴(yán)重的染色質(zhì)錯(cuò)誤折疊、長(zhǎng)程染色體間相互作用和重復(fù)基因組的不穩(wěn)定性。

文中通過(guò)CRISPR-Cas9靶向剪切FMR1基因座5’UTR區(qū)中CGG短串聯(lián)重復(fù)序列后，使用Blue Pippin全自動(dòng)DNA電泳回收儀，選用“0.75DF 3-10 kb Marker S1”試劑盒，精準(zhǔn)回收5-12 kb Cas9-cut DNA，構(gòu)建靶向長(zhǎng)讀長(zhǎng)文庫(kù)，并在MinION測(cè)序儀上進(jìn)行了長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序。

原文
Malachowski, Thomas, et al. "Spatially coordinated heterochromatinization of long synaptic genes in fragile X syndrome." Cell 186.26 (2023): 5840-5858.

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