RNA-seq聯(lián)合ChIP-seq分析揭示肝臟p53依賴的組織特異性抗輻射機制
以前的研究發(fā)現(xiàn)胸腺和脾臟是體內(nèi)輻射敏感組織，而肝臟不是。胸腺和脾臟在體內(nèi)全身輻射后會觸發(fā)p53依賴性凋亡，但這種肝臟特異性抗性的分子機制尚不清楚。
2023年03月28日，美國西奈山伊坎醫(yī)學院James J. Manfredi團隊通過對經(jīng)輻射處理的小鼠器官進行聯(lián)合RNA測序（RNA-seq）和染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）分析，鑒定出共有的和組織特異性p53轉(zhuǎn)錄反應，揭示了胸腺和脾臟共有的p53靶點富含凋亡靶點。且肝臟不能上調(diào)這些基因并不是因為基因占有率降低。小鼠模型實驗表明，p53的C末端缺失可導致肝內(nèi)p53凋亡靶點的輻射誘導表達，并伴隨細胞死亡增加。全面的RNA-seq分析顯示，C末端在肝臟特異性p53靶點的轉(zhuǎn)錄激活中需要發(fā)揮額外作用。作者推測，抑制凋亡基因表達和增強肝臟特異性靶點激活都會導致組織特異性放射抵抗。相關研究成果以“In vivo RNA-seq and ChIP-seq analyses show an obligatory role for the C terminus of p53 in conferring tissue-specific radiation sensitivity”為題發(fā)表在《Cell Reports》期刊（IF 8.8）。
研究要點：
圖形摘要
材料方法：
樣本處理：對21日齡不同基因型C57/Bl6小鼠進行2Gy精密X射線照射。X光照射的小鼠和年齡匹配的未受照射的對照小鼠在籠中保持3h。稱重21日齡不同基因型C57/Bl6小鼠，在PBS（10μg/g體重）或PBS中腹腔注射100μl阿霉素。
方法：RNA提取、qRT-PCR、RNA-seq、ChIP-seq、TUNEL（通過標記核酸末端檢測DNA片段）、免疫印跡。
研究結(jié)果：
（1）DNA損傷誘導小鼠胸腺和脾臟的p53依賴性細胞凋亡，但不誘導肝臟凋亡
圖1：DNA 損傷在胸腺和脾臟中誘導 p53 依賴性細胞凋亡，但不誘導肝臟凋亡，具有共有和組織特異性的 p53 轉(zhuǎn)錄反應
圖1A：對野生型C57/BL6小鼠進行2Gy的X射線照射6h，胸腺和脾臟出現(xiàn)大量的凋亡，而肝臟則沒有。
圖1B：使用p53基因缺失的小鼠進行同樣處理，證明胸腺和脾臟的這些效應確實是p53依賴性的。
圖1C：WB實驗確定三種組織中p53的相對表達水平。照射3h后，p53在三種組織中的表達被誘導，6h后減弱。
圖1D：定量測量p53和actin條帶的相對強度表明，這三種組織中p53的表達水平?jīng)]有差異。然而，肝臟顯示出強大的p53靶基因反應
圖1E/F：野生型和p53缺失小鼠均未接受或接受2 Gy的X射線照射，進行RNA-seq分析。
圖1G：對相應組織進行ChIP-seq分析，以確定p53的占據(jù)位點。
圖1H/I：整合RNA-seq與ChIP-seq數(shù)據(jù)，挖掘表達水平顯著改變同時也有相關peak的基因，以鑒定真正的p53靶點。
（2）X射線誘導p53直接轉(zhuǎn)錄靶標的共同核心集
圖2C：選擇了三個基因進行qRT-PCR驗證。Ccng1、Phlda3和Aen都上調(diào)了3-12倍，前兩個基因在每個組織中都明顯依賴于p53。
圖2D：在靠近轉(zhuǎn)錄起始位點的地方存在穩(wěn)健的峰，且在Phlda3中，在基因上游存在額外的峰。
圖2E：對所有20個共有基因的motif分析確定了一個的非常相似的motif。
圖2F：這些peak大部分位于p53本身或p53的上游，只有少數(shù)位于下游。
圖2G：GSEA顯示，GO_BP與先前與導致細胞凋亡的p53 DNA損傷應答相關的基因有關
（3）肝臟 p53 無法上調(diào)凋亡基因
圖3B：GSEA顯示與細胞凋亡相關的生物過程是富集率最高的。
圖3C：與凋亡過程基因集重疊的21個基因被證實其基因表達依賴于p53，并且在肝臟中不表達。
圖3D：qRT-PCR證實這些基因的一個子集（Bbc3、Pmaip1和Bax）在胸腺和脾臟中確實是選擇性靶點，但在肝臟中不是，并且它們的表達依賴于p53。一個共同的靶點Cdkn1a在所有三個組織中作為p53依賴性基因表達的陽性對照。在10周齡小鼠中檢測Bbc3 (Puma)時，在蛋白和mRNA水平發(fā)現(xiàn)了類似的組織特異性。這就提出了一種可能性，即基因表達的組織特異性可能與對X射線的不同敏感性有關。
（4）無法上調(diào)肝臟中的p53凋亡靶點不是由于基因占用減少
圖4：無法上調(diào)肝臟中的p53凋亡靶點不是由于基因占用減少
圖4A：肝臟p53不能上調(diào)凋亡靶點的分子基礎可能是由于基因占據(jù)受損或DNA結(jié)合后。為解決這個問題，作者研究了三個關鍵凋亡靶標（Bbc3、Pmaip1和Bax）的ChIP-seq圖譜。在照射胸腺和脾臟中，三個基因都觀察到強大的p53峰值。在肝臟中，這三個基因的p53占據(jù)率也相似
圖4B：為了驗證這一發(fā)現(xiàn)，野生型p53小鼠體內(nèi)用另一種DNA損傷劑多柔比星處理，并對肝臟和脾臟組織進行分析。進行qRT-PCR檢測兩個共享靶標Cdkn1a和Mdm2的mRNA水平，并與兩個凋亡靶標Bbc3和Pmaip1進行比較。與X-射線照射后的結(jié)果一致，多柔比星處理導致肝臟和脾臟中Cdkn1a和Mdm2的增加，而Bbc3和Pmaip1僅在脾臟中被誘導。
圖4C：對相應的肝臟和脾臟組織樣本進行染色質(zhì)免疫沉淀。與X-射線的結(jié)果一樣，多柔比星處理后，在肝臟和脾臟的Cdkn1a、Bbc3和Mdm2基因的反應元件上檢測到p53的占據(jù)，Alb基因的一個區(qū)域被用作陰性對照
（5）肝臟p53靶基因表達缺陷有兩種機制
圖5：肝臟p53靶基因表達缺陷有兩種機制
圖5A：然后研究了80個胸腺和脾臟靶點中有多少具有類似的特性，即它們也被p53占據(jù)但在肝臟中不被上調(diào)。
圖5B：與胸腺和脾臟相比，這些基因在肝臟中的占據(jù)率在統(tǒng)計學上更高。兩個代表性基因（Notch1, Ei24）的ChIP-seq圖譜顯示，p53在所有三個組織中都有很強的占據(jù)率。80個基因中有74個被肝臟p53占據(jù)，其中所有與GO凋亡過程基因組重疊的基因都在這里被發(fā)現(xiàn)。這些峰值主要出現(xiàn)在上游區(qū)域。將這些峰中的p53 motif進行比對，發(fā)現(xiàn)它們與之前確定的p53共識有合理的匹配。
圖5C：其余6個基因在肝臟中沒有與之相關的穩(wěn)健的p53 ChIP峰。展示了ChIP-seq圖譜的兩個例子（Hgfac和Dcaf4）。在胸腺和脾臟中發(fā)現(xiàn)的這些峰值，但在肝臟中沒有發(fā)現(xiàn)，這些峰也大多出現(xiàn)在基因體內(nèi)。這些峰中的p53 motif也與p53共識相似。
（6）p53的C末端阻止肝臟中p53細胞凋亡靶標的上調(diào)
圖6：內(nèi)源性Trp53基因表達了一個缺少最后24個氨基酸的截短蛋白。對p53Δ24/-小鼠進行X-射線處理并分析p53靶點的表達。與p53+/-小鼠相比，Δ24/-小鼠肝臟、胸腺和脾臟中某些p53靶點的表達進行了檢測。
圖6A：CTD的缺失對胸腺/脾臟中共有靶點Cdkn1a和Mdm2或胸腺/脾臟特異靶點Bbc3、Pmaip1和Bax的基因表達沒有實質(zhì)性影響。相反缺失CTD后，肝臟中Cdkn1a、Bbc3、Pmaip1和Mdm2的誘導作用增強，但Bax的誘導作用不增強。
圖6B：輻射后p53+/-肝臟中mRNA幾乎沒有變化的Bbc3，在p53Δ24/-肝臟中被輻射誘導。
圖6C：WB以確定CTD的缺失是否改變了p53蛋白的表達。多個蛋白定量證實不同組織的p53水平相當。p53蛋白水平的誘導在不同組織和基因型中同樣相似。與p53Δ24/-肝臟中Bbc3 mRNA的誘導一致，Puma蛋白也被強有力地誘導，并具有統(tǒng)計學意義（圖6B和6C）。因此，CTD的缺失允許肝臟特異性上調(diào)凋亡靶標，特別是在輻射處理后的Bbc3。
（7）p53的C端阻止X射線誘導的肝臟凋亡
圖7A右：對多個實驗中的此類顯微照片進行定量顯示增加了7倍，這與CTD缺失增強肝臟輻射敏感性的觀點一致。
圖7L/M：GSEA顯示，這兩組基因（CTD需要表達的基因和CTD抑制表達的基因）具有不同的生物學過程。
參考文獻：
Resnick-Silverman L, Zhou R, Campbell MJ, Leibling I, Parsons R, Manfredi JJ. In vivo RNA-seq and ChIP-seq analyses show an obligatory role for the C terminus of p53 in conferring tissue-specific radiation sensitivity. Cell Rep. 2023 Mar 28;42(3):112216. pii: S2211-1247(23)00227-9. doi: 10.1016/j.celrep.2023.112216. PubMed PMID: 36924496.
2023年03月28日，美國西奈山伊坎醫(yī)學院James J. Manfredi團隊通過對經(jīng)輻射處理的小鼠器官進行聯(lián)合RNA測序（RNA-seq）和染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）分析，鑒定出共有的和組織特異性p53轉(zhuǎn)錄反應，揭示了胸腺和脾臟共有的p53靶點富含凋亡靶點。且肝臟不能上調(diào)這些基因并不是因為基因占有率降低。小鼠模型實驗表明，p53的C末端缺失可導致肝內(nèi)p53凋亡靶點的輻射誘導表達，并伴隨細胞死亡增加。全面的RNA-seq分析顯示，C末端在肝臟特異性p53靶點的轉(zhuǎn)錄激活中需要發(fā)揮額外作用。作者推測，抑制凋亡基因表達和增強肝臟特異性靶點激活都會導致組織特異性放射抵抗。相關研究成果以“In vivo RNA-seq and ChIP-seq analyses show an obligatory role for the C terminus of p53 in conferring tissue-specific radiation sensitivity”為題發(fā)表在《Cell Reports》期刊（IF 8.8）。
研究要點：
- RNA-seq和ChIP-seq顯示p53輻射反應具有共有性和組織特異性
- 肝臟p53靶向凋亡靶基因，但不能調(diào)控其表達
- p53C末端抑制肝細胞凋亡基因，具有放射抗性
- p53C末端是肝臟特異性基因?qū)椛浞磻匦璧?/span>
圖形摘要
材料方法：
樣本處理：對21日齡不同基因型C57/Bl6小鼠進行2Gy精密X射線照射。X光照射的小鼠和年齡匹配的未受照射的對照小鼠在籠中保持3h。稱重21日齡不同基因型C57/Bl6小鼠，在PBS（10μg/g體重）或PBS中腹腔注射100μl阿霉素。
方法：RNA提取、qRT-PCR、RNA-seq、ChIP-seq、TUNEL（通過標記核酸末端檢測DNA片段）、免疫印跡。
研究結(jié)果：
（1）DNA損傷誘導小鼠胸腺和脾臟的p53依賴性細胞凋亡，但不誘導肝臟凋亡
圖1：DNA 損傷在胸腺和脾臟中誘導 p53 依賴性細胞凋亡，但不誘導肝臟凋亡，具有共有和組織特異性的 p53 轉(zhuǎn)錄反應
圖1B：使用p53基因缺失的小鼠進行同樣處理，證明胸腺和脾臟的這些效應確實是p53依賴性的。
圖1C：WB實驗確定三種組織中p53的相對表達水平。照射3h后，p53在三種組織中的表達被誘導，6h后減弱。
圖1D：定量測量p53和actin條帶的相對強度表明，這三種組織中p53的表達水平?jīng)]有差異。然而，肝臟顯示出強大的p53靶基因反應
圖1E/F：野生型和p53缺失小鼠均未接受或接受2 Gy的X射線照射，進行RNA-seq分析。
圖1G：對相應組織進行ChIP-seq分析，以確定p53的占據(jù)位點。
圖1H/I：整合RNA-seq與ChIP-seq數(shù)據(jù)，挖掘表達水平顯著改變同時也有相關peak的基因，以鑒定真正的p53靶點。
（2）X射線誘導p53直接轉(zhuǎn)錄靶標的共同核心集
圖2：X輻射誘導一組共有的p53直接轉(zhuǎn)錄靶標核心
圖2A/B：圖1H發(fā)現(xiàn)，20個基因在三種組織中均顯著上調(diào)，且在基因的10 kb范圍內(nèi)至少有一個peak。這20個基因的上調(diào)在所有受檢組織中都依賴于p53。圖2C：選擇了三個基因進行qRT-PCR驗證。Ccng1、Phlda3和Aen都上調(diào)了3-12倍，前兩個基因在每個組織中都明顯依賴于p53。
圖2D：在靠近轉(zhuǎn)錄起始位點的地方存在穩(wěn)健的峰，且在Phlda3中，在基因上游存在額外的峰。
圖2E：對所有20個共有基因的motif分析確定了一個的非常相似的motif。
圖2F：這些peak大部分位于p53本身或p53的上游，只有少數(shù)位于下游。
圖2G：GSEA顯示，GO_BP與先前與導致細胞凋亡的p53 DNA損傷應答相關的基因有關
（3）肝臟 p53 無法上調(diào)凋亡基因
圖3：肝臟p53無法上調(diào)凋亡基因
圖3A：為闡明胸腺和脾臟與肝臟對輻射的不同生物反應的基礎，確定了敏感組織中特異性上調(diào)的基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，80個基因在胸腺和脾臟中的表達在輻射后增加，而在肝臟中沒有變化。所有這80個基因都有與之相關的ChIP峰，并被認為是p53的真正靶標。圖3B：GSEA顯示與細胞凋亡相關的生物過程是富集率最高的。
圖3C：與凋亡過程基因集重疊的21個基因被證實其基因表達依賴于p53，并且在肝臟中不表達。
圖3D：qRT-PCR證實這些基因的一個子集（Bbc3、Pmaip1和Bax）在胸腺和脾臟中確實是選擇性靶點，但在肝臟中不是，并且它們的表達依賴于p53。一個共同的靶點Cdkn1a在所有三個組織中作為p53依賴性基因表達的陽性對照。在10周齡小鼠中檢測Bbc3 (Puma)時，在蛋白和mRNA水平發(fā)現(xiàn)了類似的組織特異性。這就提出了一種可能性，即基因表達的組織特異性可能與對X射線的不同敏感性有關。
（4）無法上調(diào)肝臟中的p53凋亡靶點不是由于基因占用減少
圖4：無法上調(diào)肝臟中的p53凋亡靶點不是由于基因占用減少
圖4B：為了驗證這一發(fā)現(xiàn)，野生型p53小鼠體內(nèi)用另一種DNA損傷劑多柔比星處理，并對肝臟和脾臟組織進行分析。進行qRT-PCR檢測兩個共享靶標Cdkn1a和Mdm2的mRNA水平，并與兩個凋亡靶標Bbc3和Pmaip1進行比較。與X-射線照射后的結(jié)果一致，多柔比星處理導致肝臟和脾臟中Cdkn1a和Mdm2的增加，而Bbc3和Pmaip1僅在脾臟中被誘導。
圖4C：對相應的肝臟和脾臟組織樣本進行染色質(zhì)免疫沉淀。與X-射線的結(jié)果一樣，多柔比星處理后，在肝臟和脾臟的Cdkn1a、Bbc3和Mdm2基因的反應元件上檢測到p53的占據(jù)，Alb基因的一個區(qū)域被用作陰性對照
（5）肝臟p53靶基因表達缺陷有兩種機制
圖5：肝臟p53靶基因表達缺陷有兩種機制
圖5B：與胸腺和脾臟相比，這些基因在肝臟中的占據(jù)率在統(tǒng)計學上更高。兩個代表性基因（Notch1, Ei24）的ChIP-seq圖譜顯示，p53在所有三個組織中都有很強的占據(jù)率。80個基因中有74個被肝臟p53占據(jù)，其中所有與GO凋亡過程基因組重疊的基因都在這里被發(fā)現(xiàn)。這些峰值主要出現(xiàn)在上游區(qū)域。將這些峰中的p53 motif進行比對，發(fā)現(xiàn)它們與之前確定的p53共識有合理的匹配。
圖5C：其余6個基因在肝臟中沒有與之相關的穩(wěn)健的p53 ChIP峰。展示了ChIP-seq圖譜的兩個例子（Hgfac和Dcaf4）。在胸腺和脾臟中發(fā)現(xiàn)的這些峰值，但在肝臟中沒有發(fā)現(xiàn)，這些峰也大多出現(xiàn)在基因體內(nèi)。這些峰中的p53 motif也與p53共識相似。
（6）p53的C末端阻止肝臟中p53細胞凋亡靶標的上調(diào)
圖6A：CTD的缺失對胸腺/脾臟中共有靶點Cdkn1a和Mdm2或胸腺/脾臟特異靶點Bbc3、Pmaip1和Bax的基因表達沒有實質(zhì)性影響。相反缺失CTD后，肝臟中Cdkn1a、Bbc3、Pmaip1和Mdm2的誘導作用增強，但Bax的誘導作用不增強。
圖6B：輻射后p53+/-肝臟中mRNA幾乎沒有變化的Bbc3，在p53Δ24/-肝臟中被輻射誘導。
圖6C：WB以確定CTD的缺失是否改變了p53蛋白的表達。多個蛋白定量證實不同組織的p53水平相當。p53蛋白水平的誘導在不同組織和基因型中同樣相似。與p53Δ24/-肝臟中Bbc3 mRNA的誘導一致，Puma蛋白也被強有力地誘導，并具有統(tǒng)計學意義（圖6B和6C）。因此，CTD的缺失允許肝臟特異性上調(diào)凋亡靶標，特別是在輻射處理后的Bbc3。
（7）p53的C端阻止X射線誘導的肝臟凋亡
圖7：p53的C末端可防止X射線誘導的肝臟細胞凋亡，并確定肝臟特異性基因表達
圖7A：為觀察CTD缺失后觀察到的基因表達變化是否會影響X射線治療后的生物學結(jié)果，對p53+/-和p53Δ24/-小鼠的肝組織進行了TUNEL檢測。顯微照片證實p53+/-肝臟在輻射前后幾乎沒有TUNEL陽性。相反，p53Δ24/-肝臟顯示TUNEL陽性細胞增加。圖7A右：對多個實驗中的此類顯微照片進行定量顯示增加了7倍，這與CTD缺失增強肝臟輻射敏感性的觀點一致。
圖7L/M：GSEA顯示，這兩組基因（CTD需要表達的基因和CTD抑制表達的基因）具有不同的生物學過程。
參考文獻：
Resnick-Silverman L, Zhou R, Campbell MJ, Leibling I, Parsons R, Manfredi JJ. In vivo RNA-seq and ChIP-seq analyses show an obligatory role for the C terminus of p53 in conferring tissue-specific radiation sensitivity. Cell Rep. 2023 Mar 28;42(3):112216. pii: S2211-1247(23)00227-9. doi: 10.1016/j.celrep.2023.112216. PubMed PMID: 36924496.
標簽：
RNA甲基化
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