酶標儀在蛋白質的相互作用驗證的應用
兩種或多種蛋白質之間的相互作⽤促進多種生物功能的發(fā)揮，構成生理過程的基礎。探究蛋⽩質的相互作⽤對于了解健康和疾病的生理過程至關重要。因此，蛋白質科學和相互作用方法可被視為生物和醫(yī)學研究中最廣泛的應用之一，并構成了藥理學理論的基礎之一。酶標儀的運用使全面記錄蛋白質結合事件成為可能。
尋找研究蛋白質互作的最佳方法
近年來，酶標儀的使用徹底改變了蛋白質相互作用研究領域，這主要歸功于檢測方法眾多。找到合適方法對于確保高數據質量和精確結果至關重要。雖然在利用酶標儀研究蛋白質相互作用的應用中，一些基于吸光度的方法（如夾心ELISA）仍在使用，但基于熒光或化學發(fā)光的方法如今更為常見，這是因為熒光或化學發(fā)光法具有靈敏度高、高通量兼容性強等優(yōu)點。在這方面，通常采用基于福斯特共振能量轉移（FRET）和生物發(fā)光共振能量轉移（BRET）的檢測方法。BRET和FRET都是基于兩個信號分子之間的能量轉移。通過將兩個信號分子連接到兩個相關蛋白質上，利用這種信號轉移來檢測二者之間的相互作用。兩種蛋白質之間的結合使附著的信號分子在空間上相互靠近，從而實現能量轉移（圖1）。
圖1：使用CFP和YFP進行 FRET檢測的示例。A) CFP 和 YFP 的光譜：CFP（供體）發(fā)射光譜與YFP（受體）激發(fā)光譜發(fā)生重疊（光譜重疊）。B) FRET示意圖：在兩種蛋白質沒有相互作用的情況下，CFP被激發(fā)并發(fā)出特定波長的光。C) 當兩者發(fā)生相互作用，FRET發(fā)生，YFP發(fā)出另一種波長的光，而CFP的發(fā)光強度會被淬滅。
基于BRET和FRET原理開發(fā)的先進應用可進一步提高蛋白質相互作用測量的靈敏度和讀出質量。比如在基于NanoBRET技術的應用中，使用從深海蝦中提取的 NanoLuc® 熒光素酶作為信號分子，與傳統(tǒng)的熒光素酶相比，信號輸出量大大增加。
下面的例子基于NanoBRET方法，能夠檢測蛋白質的泛素化過程。泛素標記需要被細胞內的酶降解的蛋白質，這一過程由蛋白質靶向嵌合體（PROTACs）促進。PROTACs的這一特性為靶向降解與疾病有關的蛋白質提供了特殊的治療潛力。我們通過動力學實驗研究蛋白質BRD4的泛素化。為此，利用CRISPR/Cas-9基因組編輯技術用HiBiT（NanoLuc熒光素酶的一個亞基）標記BRD4。并且用NanoBRET受體 HaloTag® 標記單個泛素分子。通過PROTAC ARV-771對BRD4進行泛素化，使 NanoLuc熒光素酶靠近被標記的泛素分子，從而使 BRET 信號以濃度依賴的方式隨著泛素化的進行而增加（圖2）。
圖2：監(jiān)測蛋白質BRD4泛素化的NanoBRET試驗。在泛素化過程中，隨著泛素與BRD4在空間上的接近，與BRD4相耦合的NanoLuc熒光素酶和與泛素分子相耦合的HaloTag之間基于BRET的能量轉移增加。
這一應用實例證明，在檢測極低濃度的PROTAC時，基于NanoBRET的方法靈敏度較高。
TR-FRET是將時間分辨測量與FRET原理相結合，使用的信號分子隨著時間的推移具有很高的信號穩(wěn)定性。這樣就可以利用時間窗口來測量蛋白質之間的相互作用，在相互作用信號仍可被檢測到的同時，來自檢測背景的信號已大部分消退，從而大大提高了靈敏度�；赥R-FRET的檢測通常用于研究受體與其配體的相互作用。
酶標儀在蛋白質互作研究中發(fā)揮的作用
由于上述蛋白質相互作用測定通常是在高通量條件下進行的，因此將臺式測定轉換為自動化高通量篩選（HTS）測定會受到一些特定的限制。其中的重要因素是酶標儀的靈敏度和速度，以及自動化兼容性。通過分析相互作用測量的結合曲線，可以深入了解蛋白質互作的結合動力學、解離常數和化學計量學。包括所有BMG LABTECH設備在內的先進酶標儀還可提供動力學測量，支持結合曲線的測量。
圖3：BMG LABTECH的PHERAstar® FSX是一款HTS專用多功能酶標儀。配備專用功能，是研究蛋白質相互作用的利器。
HTS專用多功能酶標儀（如BMG LABTECH的PHERAstar® FSX）是解決這些問題的理想檢測平臺。由于可提供所有常用的檢測模式，并能滿足篩選所需的性能，為檢測選擇提供了充分的靈活性。除此之外，PHERAstar® FSX酶標儀還可配備專用功能，用于更詳細、更靈敏地分析蛋白質相互作用。板載試劑移液器、同時檢測兩個發(fā)射信號（SDE）和超高速采樣等功能可實現高通量實時動力學相互作用分析。與各種機械臂平臺和軟件接口的兼容性還可使檢測實現完全自動化。
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