在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，酶標(biāo)儀是一種應(yīng)用廣泛的實(shí)驗(yàn)室儀器，可測(cè)量化學(xué)、生物或物理過程。通過將光信號(hào)（吸光度、熒光或化學(xué)發(fā)光）轉(zhuǎn)化為讀數(shù)，酶標(biāo)儀支持研究人員進(jìn)行多種生物學(xué)分析。

從實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)研究到藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)，再到診斷等應(yīng)用，酶標(biāo)儀具有強(qiáng)大的檢測(cè)能力。

那么如何讓您的酶標(biāo)儀發(fā)揮最佳性能，獲得可靠、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)呢？以下為您放送5個(gè)小貼士。

 1 

優(yōu)化增益設(shè)置

酶標(biāo)儀的測(cè)量范圍指的是可測(cè)量的最強(qiáng)和最弱信號(hào)之間的范圍，“增益”是影響此范圍的主要參數(shù)。高增益可大幅放大光信號(hào)，適用于產(chǎn)生信號(hào)較弱的樣品。低增益對(duì)信號(hào)的放大程度較小，適用于產(chǎn)生信號(hào)較強(qiáng)的樣品。增益設(shè)定取決于具體的檢測(cè)方法。增益設(shè)置過高可能會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)飽和并失去準(zhǔn)確性；增益設(shè)置過低可能導(dǎo)致低水平信號(hào)檢測(cè)效果不佳（圖1）。要找到理想的增益值，沒有放之四海而皆準(zhǔn)的答案，但可以遵循一些通用準(zhǔn)則：

避免信號(hào)飽和

避免使信號(hào)強(qiáng)度超過酶標(biāo)儀的動(dòng)態(tài)范圍。如果出現(xiàn)過飽和，會(huì)導(dǎo)致超出范圍的信號(hào)被剪切，或?qū)е骂~外信號(hào)損失。

優(yōu)化信噪比

選擇的增益值應(yīng)最/大/程度地增強(qiáng)信號(hào)，并降低背景噪音。過高的增益會(huì)放大信號(hào)，同時(shí)也可能放大噪音。找到合適的平衡點(diǎn)至關(guān)重要，這將有助于優(yōu)化信噪比。

使用校準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用一系列已知濃度的樣品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以得出需要測(cè)量可靠信號(hào)的濃度范圍，有助于確定儀器所需的最佳增益設(shè)置。

保持一致性

一旦找到能夠提供可靠、一致結(jié)果的增益值，應(yīng)盡量在相關(guān)實(shí)驗(yàn)中使用相同的設(shè)置，這將有助于確保結(jié)果的可再現(xiàn)性。

遵循制造商的建議

酶標(biāo)儀制造商會(huì)為具體的測(cè)定或分析法的提供相應(yīng)的指導(dǎo)建議，該資料是增益調(diào)節(jié)的實(shí)用參考。

對(duì)于BMG LABTECH酶標(biāo)儀的建議是，增益調(diào)節(jié)初始設(shè)置的目標(biāo)值為樣品孔預(yù)計(jì)產(chǎn)生最強(qiáng)信號(hào)的90%。在動(dòng)力學(xué)測(cè)定等應(yīng)用中，信號(hào)隨時(shí)間而變化，則建議初始將目標(biāo)值設(shè)定為空白樣品的10%。另外，比較先進(jìn)的酶標(biāo)儀具有自動(dòng)增益調(diào)節(jié)功能。CLARIOstar® Plus和VANTAstar® 配備的動(dòng)態(tài)范圍擴(kuò)展技術(shù) (EDR) 可提供8個(gè)數(shù)量級(jí)濃度的動(dòng)態(tài)范圍，無需手動(dòng)調(diào)節(jié)增益。

 

圖1：某酶標(biāo)儀的動(dòng)態(tài)范圍

 

 2 

注意閃光次數(shù)的影響

熒光或吸光度測(cè)量數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性與激發(fā)樣品的閃光次數(shù)有關(guān)，需要了解閃光次數(shù)對(duì)測(cè)量產(chǎn)生的影響（圖2）。

圖2：用于熒光檢測(cè)的光源和探測(cè)系統(tǒng)
 

一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是閃光次數(shù)與測(cè)量時(shí)間之間的權(quán)衡。酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)量所需的時(shí)間會(huì)隨著閃光次數(shù)的增加而增加。對(duì)于動(dòng)力學(xué)應(yīng)用，測(cè)量數(shù)據(jù)點(diǎn)之間的時(shí)間間隔極短，多次閃光會(huì)顯著增加測(cè)量時(shí)間。

當(dāng)應(yīng)用對(duì)速度有要求時(shí)，容易傾向于選擇較少的閃光次數(shù)。但酶標(biāo)儀可以得出多個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的平均值。使用的閃光次數(shù)越多，每次閃光之間的差異就越小。

雖然較多的閃光次數(shù)有助于提高測(cè)量的統(tǒng)計(jì)可靠性，但不建議每次測(cè)量都使用盡可能多的閃光次數(shù)，這樣會(huì)增加測(cè)量時(shí)間，而且與使用較少閃光次數(shù)的測(cè)量相比，并不一定能明顯改善數(shù)據(jù)質(zhì)量。對(duì)于多數(shù)檢測(cè)應(yīng)用，10-50次閃光是夠用的。某些特定的應(yīng)用可能需要更多的閃光次數(shù)。

總之，為一項(xiàng)檢測(cè)選擇適當(dāng)?shù)拈W光次數(shù)，有助于保持較低的變異系數(shù) (%CV) 和標(biāo)準(zhǔn)差，從而確保數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性。

 

 3 

找到理想的焦距

焦距是指酶標(biāo)儀的探測(cè)系統(tǒng)與微孔板中樣品之間的距離。最佳對(duì)焦位置是酶標(biāo)儀能檢測(cè)到樣品最高信號(hào)強(qiáng)度的平面。

了解樣品的性質(zhì)

不同的樣品需要不同的焦距來獲取樣品的最佳信號(hào)強(qiáng)度。例如，貼壁細(xì)胞樣品會(huì)在微孔板的孔底形成細(xì)胞層，接近孔底部的焦距可獲得最高的信號(hào)強(qiáng)度。先進(jìn)的酶標(biāo)儀可在測(cè)量前進(jìn)行焦距調(diào)整，自動(dòng)識(shí)別某個(gè)樣品或某組樣品的最佳焦距（圖3）。

圖3：某酶標(biāo)儀的焦距曲線

 

了解微孔板類型

如果使用的微孔板類型不同，同一樣品的最佳焦距也會(huì)有所不同。比如孔底分不同形狀，如果是圓形的，孔內(nèi)每個(gè)位置的液體深度和局部環(huán)境都略有不同。因此，相同的樣品在不同形狀的微孔板中可能會(huì)產(chǎn)生不同的焦距。不同材料或不同孔密度（如96/384/1536）的微孔板也可能需要不同的焦距高度。微孔板底座的高低也會(huì)有影響。

注意加液體積的影響

樣品的加液體積會(huì)影響焦距，在操作中應(yīng)確保一致性。如果加液體積出現(xiàn)差異，無論是無意為之還是出于其他原因，都會(huì)影響結(jié)果的可靠性。各孔之間就算相差幾微升，也會(huì)使測(cè)量結(jié)果出現(xiàn)較大偏差。

 

 4 

降低自發(fā)熒光

基于細(xì)胞的分析法（CBA）是生命科學(xué)研究不可或缺的工具。在這方面通常會(huì)遇到的一個(gè)挑戰(zhàn)是自發(fā)熒光，即生物物質(zhì)自然發(fā)出的熒光。自發(fā)熒光通常來自細(xì)胞培養(yǎng)基或細(xì)胞本身的成分。

生化檢測(cè)通常在純水或成分簡單的緩沖溶液中進(jìn)行，自發(fā)熒光可以忽略不計(jì)。但CBA通常需要額外的生物成分，如血清或氨基酸，來為細(xì)胞提供營養(yǎng)。這些額外成分會(huì)增加自發(fā)熒光。細(xì)胞也會(huì)因其成分而產(chǎn)生自發(fā)熒光。細(xì)胞中天然存在的熒光團(tuán)通常會(huì)在光譜的藍(lán)綠區(qū)發(fā)出熒光，在考慮規(guī)避其自發(fā)熒光特性的解決方案時(shí)需要考慮到這一點(diǎn)（圖 4）。

圖4：導(dǎo)致細(xì)胞自發(fā)熒光的細(xì)胞內(nèi)成分的熒光發(fā)射光譜。
 

那么，在酶標(biāo)儀上進(jìn)行CBA檢測(cè)時(shí)，應(yīng)采取哪些措施才能獲得可靠、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)呢？

緩沖液的選擇

建議選擇自發(fā)熒光較低的緩沖液，如磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)，可大程度提高信噪比。應(yīng)盡量避免在培養(yǎng)基中使用酚紅等分子，并盡可能減少血清等補(bǔ)充營養(yǎng)物的用量。對(duì)于熒光測(cè)量，可考慮使用FluoroBrite™ 等培養(yǎng)基，其自發(fā)熒光水平較低，是PBS的良好替代品。

光學(xué)元件的選擇

如果可選，建議使用底部光學(xué)元件進(jìn)行CBA的測(cè)量。這樣可以避免光線穿過細(xì)胞上方的上清液。如果研究的是貼壁細(xì)胞，底部光學(xué)元件可確保樣品發(fā)出更好的信號(hào)，并減少懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)基可能產(chǎn)生的自發(fā)熒光。

熒光團(tuán)的選擇

如果可選，應(yīng)使用紅移染料進(jìn)行檢測(cè)，以避免細(xì)胞成分產(chǎn)生自發(fā)熒光。紅移染料在波長較大的區(qū)域發(fā)射，可避免探測(cè)到藍(lán)綠區(qū)域。天然細(xì)胞熒光團(tuán)的自發(fā)熒光通常會(huì)在藍(lán)綠區(qū)域產(chǎn)生干擾，在光譜的紅色區(qū)域進(jìn)行測(cè)量有助于減少這些天然熒光團(tuán)產(chǎn)生的背景熒光。

 5 

降低異質(zhì)樣品的數(shù)據(jù)變異性

在使用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)量時(shí)，降低不必要的數(shù)據(jù)變異性非常重要。在CBA應(yīng)用中，細(xì)胞通常以非均質(zhì)的方式生長。這對(duì)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性帶來了挑戰(zhàn)。有些酶標(biāo)儀只從孔的中心讀取一個(gè)讀數(shù)，由于細(xì)胞在整個(gè)孔中分布不均勻，這個(gè)讀數(shù)可能無法反映樣品的全貌。在這種情況下，建議在多點(diǎn)采集信號(hào)，以降低數(shù)據(jù)變異性。以螺旋、軌道或矩陣模式捕獲信號(hào)的酶標(biāo)儀可確保更精確的測(cè)量（圖5）。這不僅適用于貼壁細(xì)胞等非均質(zhì)樣品，也適用于聚集的細(xì)菌和酵母。

 

圖5：孔掃描選項(xiàng)：軌道、螺旋和矩陣式掃描。

 

綜上，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，酶標(biāo)儀是一種高效、用途廣的工具。本文介紹的一些技巧有助于確保其輸出數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性。有關(guān)這5個(gè)貼士的更多信息和基于數(shù)據(jù)的證據(jù)，請(qǐng)?jiān)L問文末的“閱讀原文”。

在之后的文章中，我們還將對(duì)這些使用技巧進(jìn)行更加詳細(xì)的介紹，敬請(qǐng)持續(xù)關(guān)注！

 

轉(zhuǎn)載自：BMG LABTECH

 

 

 

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