視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（retinoblastoma, RB）是兒童期最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤，可導(dǎo)致失明甚至死亡。RB1缺失（＞90%）和MYCN擴(kuò)增（～10%）被認(rèn)為是致癌驅(qū)動事件，導(dǎo)致細(xì)胞周期更新增強(qiáng)和癌基因激活。最近的研究表明，表觀遺傳缺陷也參與RB腫瘤進(jìn)展。NSUN2介導(dǎo)的N5-甲基胞嘧啶（m5C）修飾通過激活癌基因或抑制腫瘤抑制因子參與多種腫瘤的細(xì)胞增殖和侵襲。m5C在RNA代謝中起重要作用，對于維持表觀基因組穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。然而，m5C修飾在致癌過程中的作用尚未完全明確。

2023年5月25日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第九人民醫(yī)院眼科陸琳娜、柴佩韋、范佳燕等共同通訊在《Clin Transl Med》期刊發(fā)表題為“NSUN2-mediated m5 C RNA methylation dictates retinoblastoma progression through promoting PFAS mRNA stability and expression”的研究論文，探討了NSUN2介導(dǎo)的m5C RNA甲基化如何通過促進(jìn)磷酸核糖甲酰甘氨酸脒合酶（phosphoribosylformylglycinamidine synthase，PFAS） mRNA的穩(wěn)定性和表達(dá)來影響視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（RB）的進(jìn)展。
 

標(biāo)題：NSUN2-mediated m5C RNA methylation dictates retinoblastoma progression through promoting PFAS mRNA stability and expression（NSUN2介導(dǎo)的m5C RNA甲基化通過促進(jìn)PFAS mRNA穩(wěn)定性和表達(dá)來決定視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的進(jìn)展）
時間：2023.5.25
期刊：Clin Transl Med
影響因子：IF 10.6
實驗方法：m5C甲基化RNA免疫沉淀測序（m5CmeRIP-seq）等
 
研究摘要：
本研究通過視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（RB）細(xì)胞和臨床樣品中的mRNA分離和抗m5C dot blot試驗檢測全局和mRNA m5C水平。建立原位眼內(nèi)異種移植模型以檢查RB的致癌行為，病進(jìn)行全基因組多組學(xué)分析以鑒定NSUN2的功能靶標(biāo)，包括蛋白質(zhì)組學(xué)分析，轉(zhuǎn)錄組篩選和m5C甲基化RNA免疫沉淀測序（m5C meRIP-seq）。此外進(jìn)行了基于類器官的單細(xì)胞分析和基因相關(guān)性分析，以驗證NSUN2/ALYREF/m5C PFAS致癌級聯(lián)反應(yīng)。
研究結(jié)果表明，NSUN2介導(dǎo)的m5C RNA甲基化在RB的致癌過程中促進(jìn)嘌呤的生物合成。

• 與正常視網(wǎng)膜相比，RBs中的全局和mRNA m5C水平顯著富集。
• 在RB樣品和細(xì)胞系中NSUN2的腫瘤特異性表達(dá)增加。
• 在治療上，NSUN2的靶向校正在體外和體內(nèi)均對RB中表現(xiàn)出有效的治療功效。
• 通過多組學(xué)分析，鑒定出嘌呤生物合成中的重要磷酸核糖甲酰甘氨酸脒合酶（PFAS）是NSUN2的下游候選靶標(biāo)。PFAS的重新引入在很大程度上逆轉(zhuǎn)了NSUN2缺陷型RB細(xì)胞的抑制表型，表明PFAS是NSUN2的功能性下游靶標(biāo)。
• m5C reader蛋白ALYREF負(fù)責(zé)識別PFAS的m5C修飾，通過增強(qiáng)其RNA穩(wěn)定性來增加其表達(dá)。

總之，本研究證明了NSUN2對于RB中的致癌基因激活是必需的，從而擴(kuò)展了目前對腫瘤進(jìn)展過程中動態(tài)m5C功能的理解。由于NSUN2/ALYREF/m5C PFAS致癌級聯(lián)是重要的RB觸發(fā)因素，因此本研究表明，靶向m5C重編程治療策略可能是一種新穎有效的抗腫瘤治療方法。
 

研究示意圖：NSUN2在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中上調(diào)增強(qiáng)了m5C甲基化，導(dǎo)致PFAS mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)增加以及腺苷酸（AMP）和鳥苷酸（GMP）含量提高，這些變化促進(jìn)與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤進(jìn)展相關(guān)的侵襲性增加。

研究結(jié)果
（1）NSUN2表達(dá)增加增強(qiáng)了RB的m5C修飾水平

圖1：增加的NSUN2表達(dá)增強(qiáng)了視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的m5C修飾水平。
（A-B）  斑點印跡（Dot blot）顯示m5C信號與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和正常視網(wǎng)膜組織中的亞甲基藍(lán)信號的比較。數(shù)據(jù)為三個生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD。顯著性由非配對雙尾學(xué)生t檢驗確定*p<0.05。
（C）    整合基因組學(xué)瀏覽器（IGV）顯示NSUN2在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)高于正常視網(wǎng)膜組織。
（D）    腫瘤和正常樣品中NSUN2（綠色）和DAPI染色（藍(lán)色）的免疫熒光。比例尺：左圖，50μm；右圖，25μm。
（E-F）  斑點印跡顯示與正常視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系相比，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的m5C信號與亞甲基藍(lán)信號。數(shù)據(jù)為三個生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD。顯著性由非配對雙尾學(xué)生t檢驗確定**p<0.01。
（G）    qPCR數(shù)據(jù)顯示NSUN2在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中相對于ARPE-19細(xì)胞的表達(dá)。數(shù)據(jù)為三個生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD。顯著性由非配對雙尾學(xué)生t檢驗確定*p<0.05。
（H）   IGV顯示與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系相比，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中NSUN2的更高表達(dá)。
（I）   Western blot數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析顯示，相對于ARPE-19細(xì)胞，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中NSUN2表達(dá)。數(shù)據(jù)為三個生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD。顯著性由非配對雙尾學(xué)生t檢驗確定。*p<0.05，**p<0.01。
（J）   單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示了視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中相對NSUN2蛋白表達(dá)與不同生物學(xué)過程之間的相關(guān)性*** p<0.001
 
（2）NSUN2在體外和體內(nèi)促進(jìn)RB的惡性增殖

圖2：NSUN2在體外和體內(nèi)促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的惡性增殖。
（A）   qPCR數(shù)據(jù)顯示NSUN2敲低后視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞（Y79和WERI-RB1）中NSUN2表達(dá)。數(shù)據(jù)為三個生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD。顯著性由非配對雙尾學(xué)生t檢驗確定。*p<0.05，**p<0.01。
（B）   Western Blot顯示NSUN2敲低后視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞（Y79和WERI-RB1）中NSUN2表達(dá)。數(shù)據(jù)為三個生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD。顯著性由非配對雙尾學(xué)生t檢驗確定。*p<0.05。
（C）   IGV顯示NSUN2敲低后視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞（Y79）中NSUN2表達(dá)。
（D）   斑點印跡顯示NSUN2敲低后視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞（Y79和WERI-RB1）中相對于亞甲藍(lán)信號的m5C信號。
（E）   CCK-8實驗評估NSUN2敲低后視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞（Y79和WERI-RB1）的增殖。數(shù)據(jù)為三個生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD。顯著性由非配對雙尾學(xué)生t檢驗確定。*p<0.05，***p<0.001。
（F-G） 采用軟瓊脂測定法評估NSUN2敲低后視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞（Y79和WERI-RB1）的增殖。顯示了來自三個重復(fù)的代表性圖像。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD。顯著性由不成對的兩尾學(xué)生t檢驗確定**p<0.01，***p<0.001。
（H-I）  BALB/c裸鼠和含有源自NSUN2缺陷型Y79細(xì)胞的異種移植物的眼球圖像。顯示六個生物學(xué)重復(fù)的代表性圖像。
（J）    眼球重量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。H＆E染色以評估腫瘤形成。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD。顯著性由不成對的兩尾學(xué)生t檢驗確定***p<0.001。
（K）   免疫組化染色圖像顯示對照組和NSUN2敲低組中Ki-67和NSUN2表達(dá)。比例尺：50μm。
 
（3）PFAS調(diào)控NSUN2的m5C修飾
 

圖3：多組學(xué)分析以鑒定NSUN2的潛在RNA靶標(biāo)。
（A）   火山圖顯示NSUN2缺陷型視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（Y79）細(xì)胞中NSUN2調(diào)控的基因。
（B）   NSUN2缺陷型視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（Y79）細(xì)胞中NSUN2調(diào)控基因的KEGG通路分析。
（C）   火山圖顯示NSUN2缺陷型視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（Y79）細(xì)胞中NSUN2調(diào)控的蛋白質(zhì)。
（D）   NSUN2缺陷型視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（Y79）細(xì)胞中NSUN2調(diào)控蛋白的GO富集分析。
（E）    m5C meRIP-seq數(shù)據(jù)顯示m5C位點的peaks值密度。分析了生物學(xué)重復(fù)樣品。
（F）   視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（Y79）細(xì)胞和正常視網(wǎng)膜組織中m5C修飾基因的KEGG通路分析。

 

圖4：PFAS調(diào)節(jié)NSUN2的m5C修飾。
（A）   多組學(xué)分析將PFAS鑒定為NSUN2的下游標(biāo)靶。
（B）   m5C meRIP-seq分析的IGV軌跡顯示PFAS的m5C富集。分析了生物學(xué)重復(fù)樣本。
（C）   視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中PFAS中m5C狀態(tài)的m5C-MeRIP qPCR檢測。數(shù)據(jù)三個生物學(xué)重復(fù)是平均值±SD。顯著性由非配對雙尾學(xué)生t檢驗確定。*p<0.05，**p<0.01。
（D）   m5C-MeRIP qPCR檢測NSUN2缺陷型視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中PFAS中m5C狀態(tài)。數(shù)據(jù)三個生物學(xué)重復(fù)是平均值±SD。顯著性由非配對雙尾學(xué)生t檢驗確定。
（E）   qPCR數(shù)據(jù)顯示NSUN2敲低后視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞（Y79和WERI-RB1）中PFAS的表達(dá)。數(shù)據(jù)三個生物學(xué)重復(fù)是平均值±SD。顯著性由非配對雙尾學(xué)生t檢驗確定。*p<0.05，**p<0.01。
（F）   Western Blot分析顯示NSUN2敲低后視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞（Y79和WERI-RB1）中PFAS的表達(dá)。數(shù)據(jù)三個生物學(xué)重復(fù)是平均值±SD。顯著性由非配對雙尾學(xué)生t檢驗確定。**p<0.01，***p<0.001。
（G）  免疫組織化學(xué)染色圖像顯示對照組和NSUN2敲低組中PFAS表達(dá)。比例尺：左圖，50μm；右圖，25μm。
（H）  視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤樣本隊列中NSUN2表達(dá)和PFAS表達(dá)的相關(guān)性分析（n=76）。通過Pearson相關(guān)分析確定顯著性（R=0.505，p=3.32e-06）。
 
（4）PFAS是NSUN2的功能性下游標(biāo)靶

圖5：PFAS是NSUN2的功能性下游靶標(biāo)。
  （A） qPCR數(shù)據(jù)顯示與ARPE-19細(xì)胞相比，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中PFAS的表達(dá)。數(shù)據(jù)以三次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）呈現(xiàn)。顯著性通過非配對雙尾學(xué)生t檢驗確定。**p < .01，***p < .001。
  （B）IGV顯示與正常視網(wǎng)膜組織相比，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中PFAS的更高表達(dá)。
  （C）Western Blot分析顯示與ARPE-19細(xì)胞相比，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中PFAS的表達(dá)。數(shù)據(jù)代表三次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。顯著性通過非配對雙尾學(xué)生t檢驗確定。***p < .001。
  （D）免疫熒光顯示腫瘤和正常樣本中PFAS（綠色）和DAPI染色（藍(lán)色）。比例尺：左圖，50μm；右圖，25μm。
 （E） Western Blot分析顯示不同組別視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中PFAS的表達(dá)。數(shù)據(jù)以三次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差呈現(xiàn)。顯著性通過非配對雙尾學(xué)生t檢驗確定。***p < .001，****p < .0001。
 （F） CCK8實驗評估NSUN2缺陷的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞在PFAS過表達(dá)后的增殖能力。數(shù)據(jù)以三次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差呈現(xiàn)。顯著性通過非配對雙尾學(xué)生t檢驗確定。*p < .05，**p < .01。
(G-H)  軟瓊脂實驗評估NSUN2缺陷的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞在PFAS過表達(dá)后的增殖能力。數(shù)據(jù)以三次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差呈現(xiàn)。顯著性通過非配對雙尾學(xué)生t檢驗確定。**p < .01，***p < .001。N.S.表示無顯著性。
(I-J)   BALB/c裸鼠和含有源自NSUN2缺陷且PFAS過表達(dá)的Y79細(xì)胞的異種移植物的眼球圖像。眼球重量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差呈現(xiàn)。顯著性通過非配對雙尾學(xué)生t檢驗確定。**p < .01，****p < .0001。
(K)    在NSUN2缺陷的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中檢測到PFAS過表達(dá)后的腺苷酸（AMP）和鳥苷酸（GMP）濃度。
(L)    單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示了在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中相對PFAS蛋白表達(dá)與不同生物過程之間的相關(guān)性。**p < .01，***p < .001。
 
（5）ALYREF識別m5C甲基化的PFAS并促進(jìn)其RNA穩(wěn)定性

圖6：ALYREF識別m5C甲基化的PFAS并促進(jìn)其RNA穩(wěn)定性。
（A）在用放線菌素D（10 μg/μL）處理0-10小時的NSUN2缺陷的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中PFAS的半衰期。
（B）RIP-qPCR檢測ALYREF和YBX1誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞（Y79）中PFAS的表達(dá)。
（C）單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中相對ALYREF蛋白表達(dá)與不同生物過程之間的相關(guān)性。
（D）視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤樣本隊列中ALYREF表達(dá)和PFAS表達(dá)的相關(guān)性分析（n=76）。
（E）qPCR數(shù)據(jù)顯示ALYREF敲除后視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞（Y79和WERI-RB1）中PFAS的表達(dá)。
（F）Western Blot分析顯示ALYREF敲除后視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞（Y79和WERI-RB1）中PFAS的表達(dá)。
（G）放線菌素D（10 mg/mL）處理ALYREF缺陷型視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞0-10小時PFAS的半衰期。
（H）CCK-8實驗評估ALYREF敲除后視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞（Y79和WERI-RB1）的增殖能力。
(I-J) 軟瓊脂實驗評估ALYREF敲除后視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞（Y79和WERI-RB1）的增殖能力。
(K-L) BALB/c裸鼠和含有源自ALYREF缺陷的Y79細(xì)胞的異種移植物的眼球圖像。眼球重量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。
 
研究小結(jié)：
這項研究最初證明了NSUN2通過增強(qiáng)其在RB中的RNA穩(wěn)定性來激活PFAS，擴(kuò)展了目前對腫瘤進(jìn)展過程中動態(tài)m5C功能的理解。值得注意的是，RNA上的m5C修飾對于嘌呤合成很重要，彌合了目前對RNA修飾和代謝重編程的理解。由于NSUN2/ALYREF/m5C PFAS致癌級聯(lián)是RB的重要觸發(fā)因素，因此本研究提供了一種新的治療策略，即“靶向m5C重編程策略”，這可能是一種有效的抗腫瘤治療方法。

參考文獻(xiàn)：
Zuo S, Li L, Wen X, Gu X, Zhuang A, Li R, Ye F, Ge S, Fan X, Fan J, Chai P, Lu L. NSUN2-mediated m5 C RNA methylation dictates retinoblastoma progression through promoting PFAS mRNA stability and expression. Clin Transl Med. 2023 May;13(5):e1273. doi: 10.1002/ctm2.1273. PubMed PMID: 37228185.