MeRIP-seq揭示m6A修飾在肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制中的潛在作用和新治療靶點(diǎn)
肺動(dòng)脈高壓（pulmonary arterial hypertension， PAH）是一種不可逆的心血管疾病，其特征是肺血管阻力進(jìn)行性增加，最終導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓和右心衰竭。PAH主要成因包括血管收縮、肺血管重塑和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積。肺血管重塑主要由肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）的過度增殖和抗凋亡能力引起。PAH是一種涉及遺傳、環(huán)境和表觀遺傳等多種因素的復(fù)雜疾病。表觀遺傳變化在血管重塑中的發(fā)病機(jī)制已被證實(shí)，但關(guān)于逆轉(zhuǎn)PAH的特定表觀遺傳靶點(diǎn)的了解仍然有限。
N6-甲基腺苷（m6A）是一種豐富的內(nèi)源性化學(xué)修飾，對(duì)RNA的剪接、翻譯、定位和穩(wěn)定性起著關(guān)鍵作用。m6A的動(dòng)態(tài)和可逆性由甲基轉(zhuǎn)移酶（writers）、去甲基化酶（erasers）和不同的m6A結(jié)合蛋白（readers）調(diào)控。已有研究表明，m6A調(diào)控因子的表達(dá)失衡與多種生物過程功能障礙有關(guān)，包括凋亡/增殖、發(fā)育異常、腫瘤進(jìn)展、自我更新能力降低和免疫系統(tǒng)異常。盡管有證據(jù)表明m6A酶失調(diào)參與了PAH發(fā)病機(jī)制，但m6A調(diào)控因子在PAH中的具體作用尚未明確。
2024年2月4日，中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院鳳一路博士為第一作者、宋潔為通訊作者在《Biomedicines》雜志發(fā)表題為“Transcriptome-Wide N6-Methyladenosine Alternations in Pulmonary Arteries of Monocrotaline-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Rats and Novel Therapeutic Targets”的研究論文，文章通過甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq）和RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）方法，分析單克隆素（MCT）誘導(dǎo)的PAH大鼠模型和對(duì)照組肺動(dòng)脈組織中的mRNA表達(dá)和m6A位點(diǎn)變化，通過GO和KEGG通路富集分析進(jìn)一步分析差異表達(dá)基因的功能。探討了m6A調(diào)控因子表達(dá)及其在調(diào)控PASMC生物學(xué)行為中的作用，以揭示潛在的分子機(jī)制。
研究摘要：
本研究利用MeRIP-seq和RNA-seq研究對(duì)照組和野百合堿（monocrotaline）誘導(dǎo)的PAH大鼠肺動(dòng)脈組織中m6A和RNA表達(dá)差異。使用GO和KEGG進(jìn)行功能富集分析，研究了差異表達(dá)功能。為了篩選候選m6A相關(guān)基因，使用STRING和Metascape數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，并通過對(duì)候選相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR驗(yàn)證。使用免疫組化染色、免疫熒光和Western blot技術(shù)進(jìn)一步研究了m6A調(diào)控因子的表達(dá)水平，并對(duì)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMC）進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)。研究共鑒定出42個(gè)差異表達(dá)基因，這些基因的m6A甲基化水平表現(xiàn)出增加或減少（高甲基化或低甲基化）。主要與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)、MAPK和PI3K/AKT通路相關(guān)。在PAH組中檢測(cè)到候選基因著絲粒蛋白F（CENPF）表達(dá)增加。研究首次鑒定出一種富含亮氨酸的五肽重復(fù)序列（LRPPRC）的m6A reader，該reader在PAH大鼠模型中表達(dá)下調(diào)。體外實(shí)驗(yàn)中，siRNA介導(dǎo)的Lrpprc下調(diào)導(dǎo)致大鼠PASMC增殖增強(qiáng)和Cenpf mRNA表達(dá)升高。本研究結(jié)果揭示了PAH大鼠肺動(dòng)脈中轉(zhuǎn)錄組范圍的m6A修飾圖譜變化和相關(guān)調(diào)控機(jī)制，可能為未來治療策略提供新的靶點(diǎn)。
研究思路：
研究結(jié)果
（1）PAH大鼠模型的m6A基本特征
圖1： PAH大鼠模型的m6A基本特征。組織來自肺動(dòng)脈，每組n=3。
A. 維恩圖顯示了兩組中m6A peaks（左）和基因（右）的重疊。
B. 餅圖顯示了轉(zhuǎn)錄本四個(gè)不重疊區(qū)域（（5' UTR、CDS、3' UTR和其他區(qū)域）的m6A peaks百分比。
C. 密度曲線顯示m6A peaks在轉(zhuǎn)錄本中的分布。轉(zhuǎn)錄本分為三部分，即5'UTR、CDS和3'UTR。
D. 兩組不同數(shù)量m6A peaks的基因比例。
E. 兩組RRACH motif情況。
m6A：N6-甲基腺苷；PAH：肺動(dòng)脈高壓；MCT：野百合堿；UTR：非翻譯區(qū)；CDS：編碼序列。
（2）PAH中的差異m6A分析
B. 差異m6A peaks中富集的前五個(gè)motif。
C. 具有差異m6A的上調(diào)m6A標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄本GO分析。
D. 具有差異m6A的下調(diào)m6A標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄本GO分析。
E. 具有差異m6A的上調(diào)m6A標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄本KEGG分析。
F. 具有差異m6A的下調(diào)m6A標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄本KEGG分析。
FC：倍數(shù)變化；GO：基因本體論；KEGG：京都基因與基因組百科全書。
（3）m6A修飾基因的轉(zhuǎn)錄譜
B. 具有顯著變化的peak差異表達(dá)基因的四象限圖。
C. 總體m6A與mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.1517793，p＜0.05）。
D-E. GO和KEGG分析分別具有顯著變化peak的差異表達(dá)基因。
F-G. 兩個(gè)數(shù)據(jù)集的DEG分布的火山圖。紅點(diǎn)代表上調(diào)DEG，藍(lán)點(diǎn)代表下調(diào)DEG，黑點(diǎn)代表非DEG。
H. 在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中同時(shí)上調(diào)的DEG。
I. 在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中同時(shí)下調(diào)的DEG。DEG：差異表達(dá)基因。
（4）PPI網(wǎng)絡(luò)建立和候選基因鑒定
D. MCT組和對(duì)照組（每組n=6）肺組織中Cenpf的相對(duì)mRNA表達(dá)，數(shù)據(jù)代表平均值±SEM，并使用Student t檢驗(yàn)比較兩組組間差異。
E. 血小板衍生生長(zhǎng)因子BB（PDGF-BB）刺激（30 ng/mL）下，大鼠PASMC中Cenpf mRNA相對(duì)表達(dá)水平（每組n=3），以α-Tublin作為內(nèi)部對(duì)照歸一化。
F. 人類PASMCs在PDGF-BB刺激下的CENPF mRNA相對(duì)表達(dá)水平（每組n=3），以GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照歸一化。
G. 用siRNA轉(zhuǎn)染人PASMC 48h后，經(jīng)PDGF-BB（30 ng/mL）再處理24h的CENPF mRNA相對(duì)表達(dá)水平（每組n=3）。
H-I. 以α-Tublin作為內(nèi)部對(duì)照的PCNA蛋白水平的代表性Western blot和定量分析（每組n=3）。
J. 通過IGV觀察到Cenpf mRNA轉(zhuǎn)錄本上的m6A水平。
PPI：蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作；SEM：平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差；PASMCs：肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；PDGF-BB：血小板衍生生長(zhǎng)因子BB。
（5）肺動(dòng)脈高壓（PAH）的肺動(dòng)脈中，leucine-rich pentatricopeptide repeat-containing (LRPPRC) 蛋白表達(dá)水平下降
圖5： PAH患者的肺動(dòng)脈LRPPRC表達(dá)降低。
A. 兩組（PAH和對(duì)照組）中23個(gè)m6A調(diào)控因子的表達(dá)情況熱圖。
B. 肺組織中LRPPRC的免疫組化染色（每組n=6），條形圖=100µm（左圖），放大的肺動(dòng)脈（右圖）。
C. 肺組織中LRPPRC的免疫熒光染色（每組n=6），血管染色圖像（綠色）、目標(biāo)蛋白染色圖像（紅色）、細(xì)胞核染色圖像（藍(lán)色），合并圖像（橙色），條形圖=50µm。
D-E. MCT和對(duì)照組肺組織中LRPPRC和α-Tubulin的代表性Western blot和定量分析（每組n=6）；數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM），使用學(xué)生t檢驗(yàn)比較兩組。
F-G. 大鼠PASMCs在PDGF-BB刺激下的LRPPRC水平的代表性Western blot和定量分析（30 ng/mL），以α-Tubulin作為內(nèi)部對(duì)照（每組n=3）。
H. 在PDGF-BB刺激下（30 ng/mL），人類PASMCs中LRPPRC相對(duì)mRNA表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照（每組n=3）。
（6）LRPPRC下調(diào)促進(jìn)PASMC增殖和Cenpf表達(dá)
B-C. 代表性的Western blot和PCNA水平的定量分析，以α-Tubulin作為內(nèi)部對(duì)照歸一化（每組n=3）。
D. EdU摻入實(shí)驗(yàn)評(píng)估si-Lrpprc處理的PASMCs在PDGF-BB刺激下的細(xì)胞增殖能力。條形圖=100µm。目標(biāo)細(xì)胞為紅色。
E.計(jì)算EdU染色的細(xì)胞比率。
F. Cenpf水平的相對(duì)mRNA表達(dá)（每組n=3）。
參考文獻(xiàn)：
Feng Y, Yu Z, Tang M, Li J, Peng B, Juaiti M, Tang Y, Liang B, Ouyang M, Liu Q, Song J. Transcriptome-Wide N6-Methyladenosine Alternations in Pulmonary Arteries of Monocrotaline-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Rats and Novel Therapeutic Targets. Biomedicines. 2024 Feb 4;12(2) pii: biomedicines12020364. doi: 10.3390/biomedicines12020364. PubMed PMID: 38397966.
N6-甲基腺苷（m6A）是一種豐富的內(nèi)源性化學(xué)修飾，對(duì)RNA的剪接、翻譯、定位和穩(wěn)定性起著關(guān)鍵作用。m6A的動(dòng)態(tài)和可逆性由甲基轉(zhuǎn)移酶（writers）、去甲基化酶（erasers）和不同的m6A結(jié)合蛋白（readers）調(diào)控。已有研究表明，m6A調(diào)控因子的表達(dá)失衡與多種生物過程功能障礙有關(guān)，包括凋亡/增殖、發(fā)育異常、腫瘤進(jìn)展、自我更新能力降低和免疫系統(tǒng)異常。盡管有證據(jù)表明m6A酶失調(diào)參與了PAH發(fā)病機(jī)制，但m6A調(diào)控因子在PAH中的具體作用尚未明確。
2024年2月4日，中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院鳳一路博士為第一作者、宋潔為通訊作者在《Biomedicines》雜志發(fā)表題為“Transcriptome-Wide N6-Methyladenosine Alternations in Pulmonary Arteries of Monocrotaline-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Rats and Novel Therapeutic Targets”的研究論文，文章通過甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq）和RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）方法，分析單克隆素（MCT）誘導(dǎo)的PAH大鼠模型和對(duì)照組肺動(dòng)脈組織中的mRNA表達(dá)和m6A位點(diǎn)變化，通過GO和KEGG通路富集分析進(jìn)一步分析差異表達(dá)基因的功能。探討了m6A調(diào)控因子表達(dá)及其在調(diào)控PASMC生物學(xué)行為中的作用，以揭示潛在的分子機(jī)制。
本研究利用MeRIP-seq和RNA-seq研究對(duì)照組和野百合堿（monocrotaline）誘導(dǎo)的PAH大鼠肺動(dòng)脈組織中m6A和RNA表達(dá)差異。使用GO和KEGG進(jìn)行功能富集分析，研究了差異表達(dá)功能。為了篩選候選m6A相關(guān)基因，使用STRING和Metascape數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，并通過對(duì)候選相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR驗(yàn)證。使用免疫組化染色、免疫熒光和Western blot技術(shù)進(jìn)一步研究了m6A調(diào)控因子的表達(dá)水平，并對(duì)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMC）進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)。研究共鑒定出42個(gè)差異表達(dá)基因，這些基因的m6A甲基化水平表現(xiàn)出增加或減少（高甲基化或低甲基化）。主要與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)、MAPK和PI3K/AKT通路相關(guān)。在PAH組中檢測(cè)到候選基因著絲粒蛋白F（CENPF）表達(dá)增加。研究首次鑒定出一種富含亮氨酸的五肽重復(fù)序列（LRPPRC）的m6A reader，該reader在PAH大鼠模型中表達(dá)下調(diào)。體外實(shí)驗(yàn)中，siRNA介導(dǎo)的Lrpprc下調(diào)導(dǎo)致大鼠PASMC增殖增強(qiáng)和Cenpf mRNA表達(dá)升高。本研究結(jié)果揭示了PAH大鼠肺動(dòng)脈中轉(zhuǎn)錄組范圍的m6A修飾圖譜變化和相關(guān)調(diào)控機(jī)制，可能為未來治療策略提供新的靶點(diǎn)。
研究思路：
研究結(jié)果
圖1： PAH大鼠模型的m6A基本特征。組織來自肺動(dòng)脈，每組n=3。
B. 餅圖顯示了轉(zhuǎn)錄本四個(gè)不重疊區(qū)域（（5' UTR、CDS、3' UTR和其他區(qū)域）的m6A peaks百分比。
C. 密度曲線顯示m6A peaks在轉(zhuǎn)錄本中的分布。轉(zhuǎn)錄本分為三部分，即5'UTR、CDS和3'UTR。
D. 兩組不同數(shù)量m6A peaks的基因比例。
E. 兩組RRACH motif情況。
m6A：N6-甲基腺苷；PAH：肺動(dòng)脈高壓；MCT：野百合堿；UTR：非翻譯區(qū)；CDS：編碼序列。
（2）PAH中的差異m6A分析
圖2：PAH中的差異m6A分析
A. 相對(duì)于對(duì)照組，MCT組中差異表達(dá)的m6A peaks火山圖（| log2 FC |>0.585，p<0.05）。B. 差異m6A peaks中富集的前五個(gè)motif。
C. 具有差異m6A的上調(diào)m6A標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄本GO分析。
D. 具有差異m6A的下調(diào)m6A標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄本GO分析。
E. 具有差異m6A的上調(diào)m6A標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄本KEGG分析。
F. 具有差異m6A的下調(diào)m6A標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄本KEGG分析。
FC：倍數(shù)變化；GO：基因本體論；KEGG：京都基因與基因組百科全書。
表1：差異甲基化m6A peaks和相關(guān)基因數(shù)
（3）m6A修飾基因的轉(zhuǎn)錄譜
圖3：m6A修飾基因的轉(zhuǎn)錄譜
A. 差異表達(dá)基因的火山圖。B. 具有顯著變化的peak差異表達(dá)基因的四象限圖。
C. 總體m6A與mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.1517793，p＜0.05）。
D-E. GO和KEGG分析分別具有顯著變化peak的差異表達(dá)基因。
F-G. 兩個(gè)數(shù)據(jù)集的DEG分布的火山圖。紅點(diǎn)代表上調(diào)DEG，藍(lán)點(diǎn)代表下調(diào)DEG，黑點(diǎn)代表非DEG。
H. 在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中同時(shí)上調(diào)的DEG。
I. 在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中同時(shí)下調(diào)的DEG。DEG：差異表達(dá)基因。
表2：數(shù)據(jù)庫中基因的mRNA表達(dá)水平（Log2（FC）
（4）PPI網(wǎng)絡(luò)建立和候選基因鑒定
圖4：蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)建立和候選基因鑒定
A–C. 基于上述基因構(gòu)建的中樞網(wǎng)絡(luò)。D. MCT組和對(duì)照組（每組n=6）肺組織中Cenpf的相對(duì)mRNA表達(dá)，數(shù)據(jù)代表平均值±SEM，并使用Student t檢驗(yàn)比較兩組組間差異。
E. 血小板衍生生長(zhǎng)因子BB（PDGF-BB）刺激（30 ng/mL）下，大鼠PASMC中Cenpf mRNA相對(duì)表達(dá)水平（每組n=3），以α-Tublin作為內(nèi)部對(duì)照歸一化。
F. 人類PASMCs在PDGF-BB刺激下的CENPF mRNA相對(duì)表達(dá)水平（每組n=3），以GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照歸一化。
G. 用siRNA轉(zhuǎn)染人PASMC 48h后，經(jīng)PDGF-BB（30 ng/mL）再處理24h的CENPF mRNA相對(duì)表達(dá)水平（每組n=3）。
H-I. 以α-Tublin作為內(nèi)部對(duì)照的PCNA蛋白水平的代表性Western blot和定量分析（每組n=3）。
J. 通過IGV觀察到Cenpf mRNA轉(zhuǎn)錄本上的m6A水平。
PPI：蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作；SEM：平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差；PASMCs：肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；PDGF-BB：血小板衍生生長(zhǎng)因子BB。
（5）肺動(dòng)脈高壓（PAH）的肺動(dòng)脈中，leucine-rich pentatricopeptide repeat-containing (LRPPRC) 蛋白表達(dá)水平下降
圖5： PAH患者的肺動(dòng)脈LRPPRC表達(dá)降低。
B. 肺組織中LRPPRC的免疫組化染色（每組n=6），條形圖=100µm（左圖），放大的肺動(dòng)脈（右圖）。
C. 肺組織中LRPPRC的免疫熒光染色（每組n=6），血管染色圖像（綠色）、目標(biāo)蛋白染色圖像（紅色）、細(xì)胞核染色圖像（藍(lán)色），合并圖像（橙色），條形圖=50µm。
D-E. MCT和對(duì)照組肺組織中LRPPRC和α-Tubulin的代表性Western blot和定量分析（每組n=6）；數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM），使用學(xué)生t檢驗(yàn)比較兩組。
F-G. 大鼠PASMCs在PDGF-BB刺激下的LRPPRC水平的代表性Western blot和定量分析（30 ng/mL），以α-Tubulin作為內(nèi)部對(duì)照（每組n=3）。
H. 在PDGF-BB刺激下（30 ng/mL），人類PASMCs中LRPPRC相對(duì)mRNA表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照（每組n=3）。
表3：m6A調(diào)控因子的mRNA表達(dá)水平
（6）LRPPRC下調(diào)促進(jìn)PASMC增殖和Cenpf表達(dá)
圖6：LRPPRC下調(diào)促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）的增殖和Cenpf表達(dá)。
A.在PASMCs中，用siRNA轉(zhuǎn)染PASMC 48小時(shí)，然后用PDGF-BB（30 ng/mL）再處理24小時(shí)后，Lrpprc水平的相對(duì)mRNA表達(dá)（每組n=3）。B-C. 代表性的Western blot和PCNA水平的定量分析，以α-Tubulin作為內(nèi)部對(duì)照歸一化（每組n=3）。
D. EdU摻入實(shí)驗(yàn)評(píng)估si-Lrpprc處理的PASMCs在PDGF-BB刺激下的細(xì)胞增殖能力。條形圖=100µm。目標(biāo)細(xì)胞為紅色。
E.計(jì)算EdU染色的細(xì)胞比率。
F. Cenpf水平的相對(duì)mRNA表達(dá)（每組n=3）。
參考文獻(xiàn)：
Feng Y, Yu Z, Tang M, Li J, Peng B, Juaiti M, Tang Y, Liang B, Ouyang M, Liu Q, Song J. Transcriptome-Wide N6-Methyladenosine Alternations in Pulmonary Arteries of Monocrotaline-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Rats and Novel Therapeutic Targets. Biomedicines. 2024 Feb 4;12(2) pii: biomedicines12020364. doi: 10.3390/biomedicines12020364. PubMed PMID: 38397966.
標(biāo)簽：
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