高通通量表觀基因組分析技術(shù)可用于闡明大腦中細(xì)胞復(fù)雜性的基因調(diào)控程序。5'-甲基胞嘧啶 (5mCs)是哺乳動(dòng)物基因組中最常見(jiàn)的修飾堿基，大多數(shù)5mCs發(fā)生在胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸（CpGs）上。CG差異甲基化區(qū)域 (DMRs)通常是順式調(diào)控元件（CREs）的標(biāo)志。在脊椎動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)中，5mCs也在非CpG（或CH，H=A、C或T）中被大量檢測(cè)到。CG和CH甲基化（mCG和mCH）在大腦發(fā)育過(guò)程中高度動(dòng)態(tài)變化，并表現(xiàn)出細(xì)胞類型特異性。mCG和mCH對(duì)于基因調(diào)控和大腦功能至關(guān)重要。因此基因調(diào)控需要適當(dāng)?shù)娜旧�質(zhì)折疊3D構(gòu)象，這些構(gòu)象被組織成活性（A）或抑制性（B）區(qū)、拓?fù)潢P(guān)聯(lián)域（TADs）和染色質(zhì)環(huán)（chromatin loops）。這些3D結(jié)構(gòu)促進(jìn)了基因啟動(dòng)子與其調(diào)控元件之間的互作，提供了額外但關(guān)鍵的調(diào)控機(jī)制層面。DNA甲基化與染色質(zhì)構(gòu)象互作，且過(guò)程高度相關(guān)�；�于高通量表觀基因組分析技術(shù)對(duì)大腦細(xì)胞的表觀基因組表征分析可以加深對(duì)人類大腦的復(fù)雜性基因調(diào)控的理解。
 
2023年10月13日，索爾克生物研究所Joseph R. Ecker團(tuán)隊(duì)聯(lián)合其他團(tuán)隊(duì)研究人員在《科學(xué)》（SCIENCE）雜志上發(fā)表了“Single-cell DNA methylation and 3D genome architecture in the human brain”研究論文，通過(guò)使用單核表觀基因組測(cè)序技術(shù)，全面分析成年人類大腦皮層和亞皮層區(qū)域中的DNA甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象，展示了人類大腦的單細(xì)胞DNA甲基化和3D基因組結(jié)構(gòu)圖譜，闡明了整個(gè)大腦中細(xì)胞的細(xì)胞類型特異性和不同的表觀遺傳結(jié)構(gòu)。
 

研究摘要：
闡明復(fù)雜細(xì)胞類型的基因調(diào)控程序?qū)τ诶斫饨】岛图膊≈械拇竽X功能至關(guān)重要。本研究通過(guò)在3個(gè)成年男性大腦的46個(gè)區(qū)域?qū)?17k個(gè)細(xì)胞（399k神經(jīng)元和118k非神經(jīng)元）中以單細(xì)胞分辨率的DNA甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象來(lái)全面描繪人腦細(xì)胞表觀基因組譜。研究共鑒定出188種細(xì)胞類型并表征其分子特征。綜合分析揭示了DNA甲基化、染色質(zhì)可及性、染色質(zhì)組織和跨細(xì)胞類型，皮質(zhì)區(qū)域和基底神經(jīng)節(jié)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)在細(xì)胞類型、皮層區(qū)域和基底神經(jīng)節(jié)結(jié)構(gòu)中的一致變化。進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了使用靶向基因組位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)可靠預(yù)測(cè)腦細(xì)胞類型的scMCodes方法。這種多模式表觀基因組腦細(xì)胞圖譜為成人大腦中細(xì)胞類型特異性基因調(diào)控的復(fù)雜性提供了新的見(jiàn)解。

小編就本文中的DNA甲基化研究?jī)?nèi)容進(jìn)行解讀分享。
 
甲基化研究思路

樣本：
517k 細(xì)胞（399k 神經(jīng)元和 118k 非神經(jīng)元），來(lái)自 3 個(gè)成年男性大腦的 46 個(gè)區(qū)域
技術(shù)：

1. snmC-seq3（mC） 在單細(xì)胞水平上分析所有 46 個(gè)大腦區(qū)域的 DNA 甲基化 （DNAm）
2. single-nucleus methylation sequencing單核亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的甲基胞嘧啶測(cè)序方法
3. snm3C-seq（m3C） 檢測(cè)單細(xì)胞 DNA 甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象

研究結(jié)果
（1）基于表觀基因組的腦細(xì)胞類型分類法
解剖了46個(gè)大腦區(qū)域，包括大腦皮層（CX，22個(gè)區(qū)域）、基底前腦（BF，2個(gè)區(qū)域）、基底核（BN，11個(gè)區(qū)域）、海馬體（HIP，5個(gè)區(qū)域）、丘腦（THM，2個(gè)區(qū)域）、中腦（MB，1個(gè)區(qū)域）、腦橋（PN，1個(gè)區(qū)域）和小腦（CB，2個(gè)區(qū)域）（圖1A）。大多數(shù)區(qū)域設(shè)置三個(gè)成年男性供體的三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，兩個(gè)杏仁核區(qū)域除外（BM和CEN，各兩個(gè)重復(fù)）。熒光激活細(xì)胞核分選（FANS）用于分離每個(gè)樣品中90%的NeuN陽(yáng)性細(xì)胞和10%的NeuN陰性細(xì)胞。然后使用snmC-seq3（“mC”）在單細(xì)胞水平上分析所有46個(gè)大腦區(qū)域的DNA甲基化（DNAm）。此外利用snm3C-seq（“m3C”）同時(shí)分析CX、BF和BN的17個(gè)大腦區(qū)域的單細(xì)胞DNA甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象。經(jīng)過(guò)嚴(yán)格質(zhì)控，共378940 mC和145070 m3C細(xì)胞核用于進(jìn)一步分析。每個(gè)mC細(xì)胞核平均產(chǎn)生0.94M過(guò)濾reads，而每個(gè)m3C核產(chǎn)生約2.2M reads和406k個(gè)染色質(zhì)可及性。這樣的數(shù)據(jù)質(zhì)量能夠可靠地分析各種基因組特征上的DNAm，鑒定可變甲基化區(qū)域，并精確定位不同大腦細(xì)胞類型的拓?fù)潢P(guān)聯(lián)域（TADs）和染色質(zhì)環(huán)。
 

圖1：使用snmC-seq3和snm3C-seq技術(shù)對(duì)人類大腦細(xì)胞進(jìn)行表觀基因組分析。
A. 人類大腦結(jié)構(gòu)和區(qū)域覆蓋。
B. snmC-seq3和snm3C-seq的分析模式圖。
C. 人腦核的迭代聚類和注釋： 使用t-SNE技術(shù)對(duì)整個(gè)mC數(shù)據(jù)集、抑制性/非端腦神經(jīng)元細(xì)胞類以及SubCtx-Cplx主要類型的細(xì)胞進(jìn)行可視化，根據(jù)相應(yīng)迭代中注釋的細(xì)胞組著色。
D. 主要類型的穩(wěn)健樹(shù)狀圖和亞型數(shù)量、大腦結(jié)構(gòu)和供體來(lái)源的meta信息。
E. SubCtx-Cplx主要類型的興奮性和抑制性標(biāo)記（SLC17A1和GAD1）的CH甲基化水平。
F. 按解剖區(qū)域著色的人類大腦細(xì)胞。
G. snm3C-seq分析的人腦核的2D可視化。
H. 大腦細(xì)胞類型間整體CG-和CH甲基化變化。
I. 整體DNA甲基化與MECP2和DNMT1基因表達(dá)的相關(guān)性。

通過(guò)對(duì)mC數(shù)據(jù)集進(jìn)行迭代聚類（iterative clustering），前腦分化出了最前端的端腦（telencephalon）和緊隨其后的間腦（diencephalon），后腦分裂出了后腦（metencephalon）和最末端的末腦（myelencephalon），中腦還是中腦，沒(méi)有進(jìn)一步分裂。
細(xì)胞類型通過(guò)神經(jīng)細(xì)胞的CH位點(diǎn)的低甲基化基因標(biāo)記，和非神經(jīng)細(xì)胞的CG位點(diǎn)的低甲基化標(biāo)記區(qū)分（之前提到在脊椎動(dòng)物神經(jīng)元系統(tǒng)中，5mCs 在非 CG（或 CH，H=A、C 或 T）背景下也能被大量檢測(cè)到）
盡管在不同供體中某些細(xì)胞類型的比例略有不同，但所有major types和subtypes的分類都是一致的
樹(shù)枝圖顯示了主要類型和亞型之間的關(guān)系。端腦興奮性神經(jīng)元和抑制性/非端腦神經(jīng)元與非神經(jīng)元細(xì)胞很好地區(qū)分開(kāi)來(lái)，每種類型都形成了一個(gè)特定的支系，但 CB 和 PKJ 與非神經(jīng)元細(xì)胞類型歸為一類，這可能是由于它們的整體 CG- 甲基化和 CH-甲基化程度相似。

分析結(jié)果表明：

1. 378940 mC和145070 m3C細(xì)胞核被證實(shí)可檢測(cè)跨基因組特征的DNAm；
2. 通過(guò)對(duì)mC數(shù)據(jù)集的迭代聚類，首先將細(xì)胞核分為端腦興奮性神經(jīng)元、抑制性/非端腦神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞（40種主要類型和188種亞型）；
3. 根據(jù)神經(jīng)元細(xì)胞的CH低甲基化基因標(biāo)記物和非神經(jīng)元細(xì)胞的CG低甲基化標(biāo)記物對(duì)細(xì)胞類型進(jìn)行注釋。
4. 整體甲基化水平在主要類型之間有所差異：mCG為77.7%-85.5%，mCH為0.8%-10.7%。
5. 非神經(jīng)元和顆粒細(xì)胞（DG和CB）的主要類型在mCG和mCH的整體評(píng)分最低。
6. 皮層抑制性神經(jīng)元具有最高的mCG水平，而丘腦、中腦和腦橋的某些非端腦神經(jīng)元表現(xiàn)出最高的mCH水平。
7. 細(xì)胞類型的整體甲基化與DNA甲基化reader和修飾因子的基因表達(dá)相對(duì)應(yīng)。
8. 主要mCH reader MECP2表達(dá)與整體mCH呈正相關(guān)（皮爾遜相關(guān)系數(shù)，PCC=0.39），與mCG弱相關(guān)（PCC=0.17）。
9. DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1在其表達(dá)與mCG之間呈強(qiáng)正相關(guān)（PCC=0.63），且DNMT1表達(dá)與mCH相關(guān)性更高（PCC=0.72）。
10. DNMT1與mCH之間可能存在某種尚未被發(fā)現(xiàn)的相關(guān)性。

（2）基因組組織與其他分子模式之間的關(guān)系
作者研究不同3D結(jié)構(gòu)特征與其他表觀基因組模式（mCG、mCH和開(kāi)放染色質(zhì)）之間的相關(guān)性。研究結(jié)果揭示了在所有神經(jīng)細(xì)胞類型中，mCG和mCH都與三維基因組組織呈負(fù)相關(guān)，但與染色質(zhì)開(kāi)放性存在正相關(guān)的關(guān)系，表明DNA甲基化可能促進(jìn)CTCF和cohesin。
 

圖2-I：在所有基因（左）或僅最高差異表達(dá)基因（DEGs）（右）的所有主要類型中，區(qū)室得分、邊界概率或環(huán)互作強(qiáng)度與ATAC信號(hào)、bin的mCG和mCH分?jǐn)?shù)之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)（PCC）。

在DNAm和三維基因組結(jié)構(gòu)之間觀察到的負(fù)相關(guān)性可能是由于DNAm對(duì)驅(qū)動(dòng)基因組折疊的因子（如CTCF）的結(jié)合產(chǎn)生了影響，通過(guò)高階結(jié)構(gòu)的形成招募或排除了甲基化寫入因子或清除因子（如DNMTs和TETs），或者是甲基化和基因組組織的共同調(diào)控因子。
 

圖2-J：使用所有基因（左）或最高DEG（右）的所有主要類型中不同類別的重疊（x軸），隔室得分、邊界概率或環(huán)互作強(qiáng)度和基因表達(dá)之間的PCC。

結(jié)果表明：

• 基因表達(dá)也與三維（3D）基因組結(jié)構(gòu)相關(guān)，特別是對(duì)于細(xì)胞類型特異性基因。
• 在所有神經(jīng)元主要類型中，1099（1,358）個(gè)最高差異表達(dá)基因（DEGs）與其基因體或啟動(dòng)子重疊的所有三個(gè)結(jié)構(gòu)特征顯示出強(qiáng)烈的正相關(guān)性。基因表達(dá)和/或區(qū)塊結(jié)構(gòu)信號(hào)的變異性增加與它們之間更高的正相關(guān)性相關(guān)聯(lián)，這證實(shí)了差異結(jié)構(gòu)特征和差異基因表達(dá)之間的重疊。
• 這些（負(fù)）相關(guān)性表明，活性區(qū)、強(qiáng)結(jié)構(gòu)域和環(huán)路相互作用以及開(kāi)放染色質(zhì)和甲基化耗竭之間存在協(xié)調(diào)關(guān)系，與活性染色質(zhì)狀態(tài)相對(duì)應(yīng)。
• 所有細(xì)胞類型之間的相關(guān)性普遍弱于神經(jīng)元單獨(dú)存在的相關(guān)性。

（3）細(xì)胞類型特異性DNA甲基化模式和相關(guān)基因調(diào)控譜：CG和CH甲基化與染色質(zhì)構(gòu)象的整合揭示了不同的細(xì)胞類型調(diào)控動(dòng)動(dòng)態(tài)
為了描繪細(xì)胞類型特異性的甲基化譜，作者在188種大腦細(xì)胞亞型中鑒定了24455個(gè)CH型和13096個(gè)CG型差異甲基化基因（CG-DMGs）以及2059466個(gè)CG型差異甲基化區(qū)域（CG-DMRs）（圖3A）。除了為腦細(xì)胞身份提供獨(dú)特的表觀遺傳標(biāo)記外，這些甲基化模式還提供了關(guān)鍵的見(jiàn)解，以理解腦細(xì)胞中的基因調(diào)控程序�；�因體甲基化與基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，DMRs作為潛在的順式調(diào)控元件（CREs），且轉(zhuǎn)錄因子（TF）motif暗示了候選的細(xì)胞類型特異性調(diào)控因子。
如果是低甲基化DMGs，且其motif在相同細(xì)胞類型的低甲基化DMRs（hypo-DMRs）中富集，就將TFs分配給特定的細(xì)胞類型�？偣灿�612個(gè)TFs被分配到主要的神經(jīng)元類型和亞型中，它們可能在塑造和維持細(xì)胞身份方面發(fā)揮重要角色。例如，TBR1被分配到深層興奮性神經(jīng)元，特別是L6-CT和L6b（圖3B），并注意到它在皮質(zhì)外向投射神經(jīng)元的發(fā)育中起著決定命運(yùn)的作用。ZNF423和EBF2都被分配到小腦細(xì)胞類型（圖3B）。兩者對(duì)小腦的發(fā)育至關(guān)重要，而EBF2尤其介導(dǎo)Purkinje細(xì)胞的遷移。

進(jìn)一步分析亞型突出了TF利用的變化。例如TF PBX3，TF PBX3屬于紋狀體中普遍存在的MSN-D1主要類型，僅在紋狀體區(qū)室的亞型中被低甲基化，而在紋狀體的基質(zhì)區(qū)室中沒(méi)有被低甲基化，這表明 PBX3 更傾向于在紋狀體中表達(dá)，印證了之前的觀察結(jié)果。對(duì) PBX3 的潛在結(jié)合位點(diǎn)（具有 PBX3 motif的hypo-DMRs）的進(jìn)一步研究表明，紋狀體亞型的平均甲基化分?jǐn)?shù)較低，表明這個(gè)TF在紋狀體中具有特定室的調(diào)控作用。

整合差異甲基化基因（DMGs）、差異甲基化區(qū)域（DMRs）和差異環(huán)（differential loops）來(lái)精確定位每種細(xì)胞類型的潛在順式調(diào)控元件（CREs）（圖3C）。如果一個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）位于DMR的5 Mb范圍內(nèi)，那么這個(gè)基因就被認(rèn)為是與DMR相關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步細(xì)化保留與環(huán)或差異環(huán)（DL）的兩個(gè)錨點(diǎn)重疊的DMR-DMG對(duì)。計(jì)算不同細(xì)胞亞型中DMR的mCG分?jǐn)?shù)與基因體的mCH分?jǐn)?shù)之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)（PCC）來(lái)評(píng)估這種關(guān)聯(lián)。特別對(duì)于經(jīng)過(guò)DL篩選的DMRs，觀察到了增強(qiáng)的相關(guān)性（圖3D），這些DMRs也顯示出與開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域的重疊增加（圖3E）。在1122919個(gè)DMRs和12327個(gè)基因之間鑒定出3.2M潛在的調(diào)控性DMR/基因?qū)�。這些DMRs、DMGs的甲基化分?jǐn)?shù)以及它們互作強(qiáng)度（環(huán)）呈現(xiàn)出（負(fù)）相關(guān)性（圖3F），這些因素共同協(xié)調(diào)特定的基因調(diào)控程序。例如，編碼突觸結(jié)合蛋白-1（Synaptotagmin-1）的基因SYT1，在L2/3-IT神經(jīng)元中展現(xiàn)出較低的遠(yuǎn)端DMRs和SYT1基因體的甲基化分?jǐn)?shù)，并且與DMRs和啟動(dòng)子之間的相互作用比MSN-D1神經(jīng)元更強(qiáng)（圖3G），導(dǎo)致SYT1在L2/3-IT中的表達(dá)高于MSN-D1（圖3G）。總體而言，CG和CH甲基化與染色質(zhì)構(gòu)象的整合揭示了不同細(xì)胞類型的調(diào)控動(dòng)態(tài)。

通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）確定了許多與腦部疾病相關(guān)的非編碼位點(diǎn)，其中很多位于增強(qiáng)子區(qū)域。DMRs和loops有助于將這些遺傳變異定位到特定細(xì)胞類型的調(diào)控元件上。使用連鎖不平衡得分回歸（LDSC）方法，檢測(cè)到20種腦部疾病或性狀與人類大腦細(xì)胞中的DMRs或與環(huán)重疊的DMRs之間的關(guān)聯(lián)（圖3H）。精神分裂癥、雙相情感障礙和神經(jīng)質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)變異在皮質(zhì)和海馬體的興奮性神經(jīng)元的低甲基化DMRs中顯著富集，而阿爾茨海默�。ˋD）與小膠質(zhì)細(xì)胞（MGC；圖3H）相關(guān)。煙草使用障礙變異與基底節(jié)的Foxp2細(xì)胞類型相關(guān)（圖3H），這是一個(gè)與煙草成癮相關(guān)的區(qū)域。對(duì)疾病風(fēng)險(xiǎn)變異的進(jìn)一步探索揭示了對(duì)基因調(diào)控的多樣化影響。盡管許多細(xì)胞類型與相同的疾病有關(guān)，但它們所涉及的風(fēng)險(xiǎn)變異可能多樣。例如，精神分裂癥風(fēng)險(xiǎn)變異rs2789588在L2/3-IT和L6-CT神經(jīng)元中都有所涉及，具有相似的表觀遺傳特征，但rs17194490僅在L2/3-IT中涉及，與相應(yīng)基因的特定DNA低甲基化、更強(qiáng)的長(zhǎng)距離相互作用和與L6-CT相比更高的基因表達(dá)相關(guān)。
 

圖3：大腦細(xì)胞中的基因調(diào)控

（4）人、鼠腦細(xì)胞類型和DMR的保守性
研究人員分析了靈長(zhǎng)類動(dòng)物（人類）和嚙齒類動(dòng)物（小鼠）之間在大腦細(xì)胞類型上的保守性。通過(guò)比較人類和小鼠的單核DNA甲基化圖譜，范圍覆蓋大腦皮層、基底前腦、基底核和海馬體等相應(yīng)區(qū)域。整合分析表明，人類大腦中定義的三種主要類型與小鼠腦細(xì)胞不一致（圖5A），小鼠L4-IT神經(jīng)元只對(duì)應(yīng)于人類L4-IT神經(jīng)元亞群（圖5B），證實(shí)了人類L4-IT神經(jīng)元中存在更大的異質(zhì)性。人類海馬體中的HIP-Misc1神經(jīng)元與一些小鼠皮層IT神經(jīng)元整合，而HIP-Misc2神經(jīng)元與任何小鼠細(xì)胞類型均不對(duì)應(yīng)。平行snRNA數(shù)據(jù)集驗(yàn)證了這兩種人類海馬體細(xì)胞類型（圖5C）。盡管未匹配的細(xì)胞類型需要進(jìn)一步研究，但主要類型的分類在人類和小鼠之間更廣泛的大腦區(qū)域通常是保守的（圖5A），而對(duì)于相應(yīng)的細(xì)胞類型，人類的整體CG和CH甲基化水平始終高于小鼠（圖5D）。

為了比較人腦和小鼠大腦之間的基因調(diào)控，研究者使用liftOver匹配在單個(gè)物種內(nèi)鑒定的主要類型低甲基化差異區(qū)域（hypo-DMRs）（圖5E）。跨細(xì)胞類型的40~60%的hypo-DMRs在另一種物種中具有同源序列（將這些DMRs稱為OrthSeqs）。大約一半的OrthSeqs在另一種物種中的同源物也是hypo-DMRs（OrthDMRs）。大多數(shù)（95%）OrthDMRs相互匹配（CnsvDMRs；圖5F）。CnsvDMRs的甲基化分?jǐn)?shù)在人鼠細(xì)胞類型間顯示出顯著的相關(guān)性（圖5, G和H），表明功能在物種間保守。

研究者進(jìn)一步選擇了相關(guān)性最高的DMRs（hcCnsvDMRs，圖5G）。hcCnsvDMRs的功能富集分析表明，它們?cè)谂c前腦發(fā)育相關(guān)的生物過(guò)程和與樹(shù)突和突觸相關(guān)的細(xì)胞組分中富集（圖5F和G）。與小鼠前腦的組蛋白修飾比較表明，這些DMRs在異染質(zhì)區(qū)域（H3K9me3）中缺失，在增強(qiáng)子（H3K27ac和H3K4me1）、啟動(dòng)子（H3K4me3）和poised增強(qiáng)子（H3K27me3）區(qū)域中富集。根據(jù)染色質(zhì)可及性將hcCnsvDMRs進(jìn)一步分類為開(kāi)放或關(guān)閉狀態(tài)，結(jié)果表明開(kāi)放DMRs在增強(qiáng)子和啟動(dòng)子中富集。而關(guān)閉的DMRs在poised增強(qiáng)子中特別富集（圖5I），這些增強(qiáng)子可能在發(fā)育過(guò)程中活躍。

物種間的甲基化保守性暗示了通過(guò)比較表觀遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)子的策略。例如，Pvalb神經(jīng)元的特定基因INPP5J，有許多遠(yuǎn)端和近端的hcCnsvDMRs與匹配的染色質(zhì)可及區(qū)域重疊（圖5J），包括兩個(gè)被驗(yàn)證為小鼠Pvalb神經(jīng)元病毒靶向的特定增強(qiáng)子（圖5J）。
 

圖5：人類和小鼠大腦細(xì)胞甲基化組的跨物種比較。

A. 2D t-SNE可視化人類和小鼠大腦之間的單細(xì)胞甲基組化整合。
B. L4-IT、HIP-Misc1和HIP-Misc2細(xì)胞類型中，人類和小鼠大腦的細(xì)胞類型差異。
C. TF TSHZ2在HIP-Misc1和HIP-Misc2細(xì)胞類型中，CH低甲基化和基因表達(dá)。
D. 人類和小鼠之間保守細(xì)胞類型的整體mCH和mCG相關(guān)性。
E. 跨物種匹配細(xì)胞類型DMRs示意圖。
F. 大約50%的DMRs在另一個(gè)物種中具有同源序列，其中約25%是相互對(duì)應(yīng)的DMRs。
G. 跨物種DMR甲基化相關(guān)性分布（紅色）和隨機(jī)背景（黑色）。
H. hcCnsvDMRs的甲基化分?jǐn)?shù)示例。
I. hcCnsvDMRs在組蛋白修飾標(biāo)記中的富集情況。
J. 在Pvalb主要類型中，圍繞INPP5J基因的hcCnsvDMRs的瀏覽器視圖。
 
（5）單細(xì)胞甲基化條形碼 （scMCodes） 可靠地預(yù)測(cè)人腦細(xì)胞身份。
細(xì)胞基因組中的DNA甲基化變化包含了代表過(guò)去和現(xiàn)在基因調(diào)控事件的分子“印記”，許多CpG位點(diǎn)上大腦細(xì)胞類型的DNA甲基化模式具有高度特異性。為此，作者設(shè)計(jì)了單細(xì)胞甲基化條碼（scMCodes），通過(guò)選定CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)來(lái)確定單個(gè)細(xì)胞水平上的大腦細(xì)胞類型（圖6A）。

首先通過(guò)迭代選擇區(qū)分大腦細(xì)胞類型的CpG位點(diǎn)，然后根據(jù)其在不同細(xì)胞類型間的甲基化模式，將這些位點(diǎn)進(jìn)一步聚類成39k個(gè)群體。接著通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)模型交叉驗(yàn)證評(píng)估了它們的細(xì)胞類型預(yù)測(cè)能力，最終選擇800個(gè)群體共12000個(gè)CpG位點(diǎn)作為scMCodes（圖6B和C），以在保持特征數(shù)最小化同時(shí)實(shí)現(xiàn)良好的預(yù)測(cè)能力。這些scMCodes達(dá)到約93%的準(zhǔn)確率（圖6D）。
在本研究的三個(gè)供體和一個(gè)外部個(gè)體之間進(jìn)行了跨供體測(cè)試。結(jié)果顯示高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率（92~96%；圖6E），證明了scMCode方法在跨個(gè)體上的穩(wěn)健性。單細(xì)胞測(cè)序的基因組覆蓋有限，平均每個(gè)細(xì)胞中只檢測(cè)到約200個(gè)scMCodes的CpG位點(diǎn)（圖6F），強(qiáng)調(diào)了scMCode使用少數(shù)選定的甲基化位點(diǎn)來(lái)確定人類大腦細(xì)胞類型的scMCode方法有效性。
 

圖6：大腦細(xì)胞類型的snMCodes。

A. snMCodes的工作流程。
B. 來(lái)自所有三位供體的snMCodes。
C. snMCode特征的細(xì)胞類型特異性示例。
D. snMCodes在預(yù)測(cè)細(xì)胞類型時(shí)的混淆矩陣熱圖。
E. 跨供體測(cè)試中的細(xì)胞類型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率。
F. snMCodes能夠在單細(xì)胞分辨率下使用有限數(shù)量的CpG位點(diǎn)預(yù)測(cè)人類細(xì)胞類型

Discussion
研究人員編制了一個(gè)全面的單細(xì)胞DNA甲基化和人類大腦3D基因組結(jié)構(gòu)圖譜，并比較了不同大腦區(qū)域相同細(xì)胞類型的表觀遺傳多樣性。DNA甲基化（DNAm）中編碼的復(fù)雜調(diào)控信息使我們能夠提煉出一組單細(xì)胞甲基化條碼（scMCodes），用于可靠的細(xì)胞類型識(shí)別。鑒于循環(huán)游離DNA（cfDNA）甲基化已被認(rèn)定為癌癥診斷的有力工具，并且為腦部疾病提供了有希望的生物標(biāo)志物。

研究通過(guò)單細(xì)胞分析技術(shù)揭示的DNA甲基化模式在理解和分類大腦細(xì)胞類型中的重要性。研究人員利用這些信息開(kāi)發(fā)了scMCodes，可以在單細(xì)胞水平上準(zhǔn)確地鑒定和分類細(xì)胞類型。此外，cfDNA中的甲基化模式的研究不僅在癌癥診斷中顯示出潛力，也為腦部疾病的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)提供了新的方向。這些發(fā)現(xiàn)可能對(duì)開(kāi)發(fā)新的診斷方法和治療策略具有重要意義。
 
參考文獻(xiàn)：
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