基于亞硫酸鹽測(cè)序的交集時(shí)鐘揭示人類(lèi)胚胎發(fā)生過(guò)程中年輕化事件
最近的研究揭示了小鼠的早期發(fā)育過(guò)程中的年輕化事件（rejuvenation event）。本文通過(guò)檢測(cè)人類(lèi)胚胎發(fā)生過(guò)程中的表觀遺傳年齡動(dòng)態(tài)變化，分析人類(lèi)是否也存在類(lèi)似事件。為此，研究人員開(kāi)發(fā)了一種表觀遺傳時(shí)鐘方法——交集時(shí)鐘（intersection clock），該方法利用亞硫酸鹽測(cè)序，最大限度利用信息豐富的CpG位點(diǎn)，并確保檢測(cè)樣本中沒(méi)有缺失的時(shí)鐘CpG位點(diǎn)，將其應(yīng)用于人類(lèi)胚胎發(fā)育數(shù)據(jù)。分析結(jié)果表明，在卵裂期和囊胚期胚胎之間預(yù)測(cè)的表觀遺傳年齡沒(méi)有變化；然而在囊胚和代表外胚層的細(xì)胞之間觀察到表觀遺傳年齡顯著下降。通過(guò)將交集時(shí)鐘應(yīng)用于跨越植入前和植入后的數(shù)據(jù)集，結(jié)果揭示了在植入前階段的表觀遺傳年齡沒(méi)有顯著變化；而植入后樣本的表觀遺傳年齡較低。進(jìn)一步研究了primed（重編程細(xì)胞，早期植入后階段）和naïve（未重編程細(xì)胞，植入前階段）誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）的表觀遺傳年齡，并觀察到在所有情況下，primed細(xì)胞的表觀遺傳年齡顯著低于naïve細(xì)胞�？偟膩�(lái)說(shuō)，本研究數(shù)據(jù)分析表明人類(lèi)胚胎在早期胚胎發(fā)生過(guò)程中經(jīng)歷了年輕化。因此，年輕化事件在小鼠和人類(lèi)之間是保守的，且在兩個(gè)物種中都發(fā)生在原腸胚形成（gastrulation）階段。此外，本研究的交集時(shí)鐘為基于人類(lèi)亞硫酸鹽測(cè)序數(shù)據(jù)集的其他表觀遺傳年齡研究開(kāi)辟了道路。
背景
生殖細(xì)胞系在成年生活中會(huì)經(jīng)歷與年齡相關(guān)的變化。有人提出，在受精后的后代中生殖細(xì)胞可能會(huì)經(jīng)歷年輕化。研究人員基于這一想法進(jìn)行基于數(shù)據(jù)的測(cè)試，應(yīng)用表觀遺傳時(shí)鐘來(lái)追蹤生物年齡（即基于分子標(biāo)記的年齡）的變化，并揭示了小鼠胚胎發(fā)生早期的年輕化事件。結(jié)果表明，胚胎第6.5/7.5天樣本的平均表觀遺傳年齡與胚胎發(fā)生早期階段相比始終較低，使用不同的概率時(shí)鐘（scAge）進(jìn)行單細(xì)胞分析也顯示了類(lèi)似模式。這個(gè)胚胎時(shí)期大約對(duì)應(yīng)于原腸胚形成。然而，人類(lèi)是否存在類(lèi)似的年輕化事件仍然是一個(gè)未解的問(wèn)題。為此，研究人員評(píng)估了人類(lèi)早期胚胎發(fā)生過(guò)程中的表觀遺傳年齡動(dòng)態(tài)變化。
表觀遺傳時(shí)鐘基于CpG位點(diǎn)的甲基化水平，是生物年齡的有前景的分子估計(jì)器。這些時(shí)鐘可以定量分析人類(lèi)衰老的多個(gè)方面。盡管有多種基于人類(lèi)甲基化陣列的表觀遺傳時(shí)鐘可用，但基于人類(lèi)亞硫酸鹽測(cè)序的老化時(shí)鐘尚未開(kāi)發(fā)。這可能是因?yàn)橹钡阶罱�，還沒(méi)有可用的亞硫酸鹽測(cè)序數(shù)據(jù)（具有足夠數(shù)量的年齡metadata的樣本）適合用于訓(xùn)練（training）表觀遺傳時(shí)鐘。
分析結(jié)果：
為了評(píng)估人類(lèi)胚胎發(fā)生的表觀遺傳年齡動(dòng)態(tài)變化，需要基于人類(lèi)亞硫酸鹽測(cè)序數(shù)據(jù)的表觀遺傳時(shí)鐘方法，因?yàn)橹挥羞@種類(lèi)型的數(shù)據(jù)對(duì)人類(lèi)胚胎可用（表S1）。因此開(kāi)發(fā)了一種新的表觀遺傳時(shí)鐘方法，即“交集時(shí)鐘”（圖1），并使用182個(gè)人類(lèi)血液樣本的可用簡(jiǎn)化還原性亞硫酸鹽測(cè)序（RRBS）數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練（表S1中的數(shù)據(jù)集1，圖S1）。交集時(shí)鐘針對(duì)亞硫酸鹽測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化，其中訓(xùn)練集和測(cè)試數(shù)據(jù)集之間重疊的CpG位點(diǎn)數(shù)量不足，無(wú)法進(jìn)行可靠預(yù)測(cè)。交集時(shí)鐘最大限度利用在測(cè)試樣本中沒(méi)有丟失時(shí)鐘CpG位點(diǎn)的信息性CpG位點(diǎn)。通過(guò)在訓(xùn)練數(shù)據(jù)集和測(cè)試樣本數(shù)據(jù)之間的交集CpG位點(diǎn)上進(jìn)行訓(xùn)練和測(cè)試來(lái)預(yù)測(cè)測(cè)試樣本的年齡。因此，交集時(shí)鐘方法保證在測(cè)試樣本中沒(méi)有丟失的時(shí)鐘CpG位點(diǎn)。盡管這種方法需要為每個(gè)數(shù)據(jù)集訓(xùn)練新的表觀遺傳時(shí)鐘，但它最大程度提高了這些數(shù)據(jù)集的效用。
表S1：本研究中使用的胚胎 DNA 甲基化數(shù)據(jù)集和樣本，從可用的數(shù)據(jù)集中選擇了人類(lèi)RRBS/WGBS批量樣本。
DCM：擴(kuò)張型心肌�。籈S細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞；GW：妊娠周；HNES細(xì)胞：人類(lèi)幼稚胚胎干細(xì)胞；iPSCs：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；MII卵母細(xì)胞：中期II卵母細(xì)胞；P：通道；PSCs：多能干細(xì)胞；RRBS：減少代表性亞硫酸鹽測(cè)序；WGBS：全基因組亞硫酸鹽測(cè)序。
圖1：交集時(shí)鐘工作流程示意圖。對(duì)每個(gè)測(cè)試樣本進(jìn)行表觀遺傳年齡預(yù)測(cè)，工作流程如下：
補(bǔ)充圖S1：按條件、性別和年齡分列的182個(gè)訓(xùn)練樣本（人類(lèi)血液）的分布情況。
SA：自殺未遂者；MDD：重度抑郁癥。
為了評(píng)估胚胎發(fā)生過(guò)程中的表觀遺傳年齡動(dòng)態(tài)變化，收集可用的人類(lèi)DNA甲基化（DNAm）數(shù)據(jù)集（數(shù)據(jù)集2-4），并使用交集時(shí)鐘進(jìn)行分析。交集時(shí)鐘對(duì)僅限于交集CpG位點(diǎn)訓(xùn)練集上的交集驗(yàn)證中表現(xiàn)出高性能（圖2a-c）。數(shù)據(jù)集2中的一項(xiàng)研究使用RRBS生成了人類(lèi)植入前發(fā)育和胚胎干細(xì)胞（代表人類(lèi)外胚層）的全基因組甲基化圖。研究人員處理了包括精子、卵裂、囊胚和人類(lèi)胚胎干細(xì)胞（ES）細(xì)胞在內(nèi)的所有人類(lèi)樣本的甲基化水平，觀察到卵裂期和囊胚期胚胎的預(yù)測(cè)表觀遺傳年齡之間沒(méi)有顯著變化（p = 0.7378）；囊胚和ES細(xì)胞的表觀遺傳年齡顯著下降（p=1.582e-12）（圖2e）。小鼠外胚層（E6.5）與人類(lèi)ES細(xì)胞之間的跨物種比較表明，這些ES細(xì)胞是人類(lèi)外胚層的合理替代物；因此數(shù)據(jù)表明，人類(lèi)植入后外胚層的表觀遺傳年齡也低于植入前階段的表觀遺傳年齡。進(jìn)一步將交集時(shí)鐘應(yīng)用于另外兩個(gè)數(shù)據(jù)集（數(shù)據(jù)集3和4），其中包含植入前（受精卵、卵裂、桑椹胚和囊胚）和植入后（GW 6-11肝臟和絨毛）樣本。觀察到植入前階段之間沒(méi)有顯著變化；但植入后樣本的表觀遺傳年齡顯著下降（圖2f，g）�？偟膩�(lái)說(shuō)數(shù)據(jù)表明人類(lèi)胚胎在早期胚胎發(fā)生期間年輕化。
圖2：交集時(shí)鐘揭示人類(lèi)早期胚胎發(fā)生期間的年輕化事件。
(a-d、i、k、m) 交集CpG位點(diǎn)數(shù)量和交集驗(yàn)證（CV）模型性能：圖表展示交集時(shí)鐘在不同數(shù)據(jù)集（Datasets2–8）上的交集CpG位點(diǎn)數(shù)量以及交集驗(yàn)證模型的性能。性能通過(guò)Pearson相關(guān)系數(shù)（r）和平均絕對(duì)誤差中位數(shù)（MedAE）評(píng)估。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)測(cè)試樣本，CV性能在交集CpG位點(diǎn)的訓(xùn)練集（Dataset1）中分析。
(e-g) 不同人類(lèi)發(fā)育階段樣本的平均預(yù)測(cè)年齡（表觀遺傳年齡）：圖表顯示交集時(shí)鐘對(duì)不同人類(lèi)發(fā)育階段樣本（來(lái)自Datasets2–4）的平均預(yù)測(cè)年齡。在數(shù)據(jù)集2中，ES細(xì)胞代表植入后外胚層。
(h) 圖表展示交集時(shí)鐘對(duì)健康對(duì)照組和擴(kuò)張型心肌病患者的纖維細(xì)胞及其衍生的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）（來(lái)自Dataset5）的平均預(yù)測(cè)年齡。
(j、l、n) 圖表展示交集時(shí)鐘對(duì)不同數(shù)據(jù)集（Datasets6–8）的naïve細(xì)胞（重置細(xì)胞、HNES1細(xì)胞）和primed（常規(guī)PSCs，primed HNES1細(xì)胞，代表植入后外胚層）胚胎干細(xì)胞（ESC）樣本的平均預(yù)測(cè)年齡（表觀遺傳年齡）。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證該方法分析年輕化事件的能力，將交集時(shí)鐘應(yīng)用于人類(lèi)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）數(shù)據(jù)集（Dataset 5）。結(jié)果表明，成年對(duì)照組（p=0.0136）和擴(kuò)張型心肌病患者（2.679e-05）的成纖維細(xì)胞重編程后，表觀遺傳年齡顯著下降（圖2d、h）。
數(shù)據(jù)集2-4不僅包含胚胎數(shù)據(jù)，還包括精子數(shù)據(jù)，在數(shù)據(jù)集3中還包括MII卵母細(xì)胞樣本。將交集時(shí)鐘應(yīng)用于這些樣本的甲基化譜，發(fā)現(xiàn)精子細(xì)胞的表觀遺傳年齡在某些情況下低于植入前階段：在數(shù)據(jù)集2和3中的差異顯著（圖2e、f），而在數(shù)據(jù)集4中的差異不顯著（圖2g）。此外，人類(lèi)MII卵母細(xì)胞和植入前胚胎之間的表觀遺傳年齡沒(méi)有顯著差異（圖2f），盡管精子細(xì)胞的表觀遺傳年齡顯著低于MII卵母細(xì)胞。目前尚不清楚雄性生殖細(xì)胞在配子發(fā)生過(guò)程中是否也會(huì)經(jīng)歷年輕化。
無(wú)論是來(lái)源于囊胚還是通過(guò)重編程生成的常規(guī)人類(lèi)多能干細(xì)胞（PSCs），都與小鼠胚胎干細(xì)胞不同，代表了多能性的發(fā)育晚期或啟動(dòng)階段。通過(guò)體外重置常規(guī)PSCs或直接從ICM捕獲細(xì)胞開(kāi)發(fā)了多種方法來(lái)生成更接近原始表型的PSCs。通過(guò)將交集時(shí)鐘應(yīng)用于數(shù)據(jù)集6-8，primed（代表早期植入后）和naïve（代表植入前）PSCs的表觀遺傳年齡，并觀察到在所有情況下，primed細(xì)胞的表觀遺傳年齡顯著低于naïve細(xì)胞（圖2i-n）。
總之，這些數(shù)據(jù)支持了年輕化事件發(fā)生在人類(lèi)早期胚胎發(fā)育期間的假設(shè)。
DISCUSSION
本研究結(jié)果重現(xiàn)了在小鼠中的發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)胚胎第6.5/7.5天樣本的表觀遺傳年齡與早期胚胎發(fā)生階段相比始終較低。因此，胚胎年輕化事件在小鼠和人類(lèi)之間保守，并且在兩個(gè)物種中都發(fā)生在胚胎發(fā)育的原腸胚形成階段。數(shù)據(jù)支持人類(lèi)胚胎發(fā)生過(guò)程中實(shí)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于生物體最低生物學(xué)年齡的“歸零（ground zero）”模型。隨著對(duì)“ground zero”認(rèn)識(shí)的不斷發(fā)展，可能會(huì)改變對(duì)人類(lèi)生物體生命開(kāi)始的看法。
在某些情況下，精子細(xì)胞的表觀遺傳年齡低于MII卵母細(xì)胞和植入前階段胚胎。本研究分析了胚胎年輕化，但目前尚不清楚生殖細(xì)胞發(fā)育和配子發(fā)生是否也與年輕化有關(guān)，需要進(jìn)一步研究來(lái)闡明這一點(diǎn)。
在唯一可用的潛在訓(xùn)練數(shù)據(jù)集（數(shù)據(jù)集1）中，最年長(zhǎng)的健康患者是40歲，而年長(zhǎng)患者表現(xiàn)出不良的健康表型（SA或MDD，圖S1）。盡管最初研究揭示了健康組與SA組、健康組與MDD組之間的甲基化譜存在顯著差異，但至少部分差異可能是由于健康組與SD/MDD組之間的平均年齡差異所致。同樣可能的是，區(qū)分健康組和SD/MDD組的CpG位點(diǎn)與表觀遺傳時(shí)鐘使用的CpG位點(diǎn)不同�？偟膩�(lái)說(shuō)，在這種情況下，使用所有數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練過(guò)程是合理的。
先前基于甲基化芯片的人類(lèi)iPSCs表觀遺傳年齡評(píng)估顯示，在重編程過(guò)程中表觀遺傳年齡下降（即年輕化）。本研究基于人類(lèi)亞硫酸鹽測(cè)序數(shù)據(jù)驗(yàn)證了這些結(jié)果（圖2h），并表明交集時(shí)鐘可以檢測(cè)到年輕化。
人類(lèi)胚胎的全基因組CpG甲基化在植入前發(fā)育期間從受精卵到囊胚階段逐漸減少，隨后在植入后胚胎（代表性primed PSCs）中全基因組CpG甲基化增加。相比之下，植入前發(fā)育期間（受精卵、卵裂、桑椹胚和囊胚階段；圖2e-g）表觀遺傳年齡沒(méi)有顯著變化，隨后在植入后胚胎（代表性primed PSCs）中表觀遺傳年齡下降（圖2e-g、j、l、n）。這些數(shù)據(jù)表明，DNA甲基化維持和de novo甲基化在年輕化事件中發(fā)揮作用，和之前在小鼠中的結(jié)果一致。
參考文獻(xiàn)：
Kerepesi C, Gladyshev VN. Intersection clock reveals a rejuvenation event during human embryogenesis. Aging Cell. 2023 Oct;22(10):e13922. doi: 10.1111/acel.13922. PubMed PMID: 37786333.
背景
生殖細(xì)胞系在成年生活中會(huì)經(jīng)歷與年齡相關(guān)的變化。有人提出，在受精后的后代中生殖細(xì)胞可能會(huì)經(jīng)歷年輕化。研究人員基于這一想法進(jìn)行基于數(shù)據(jù)的測(cè)試，應(yīng)用表觀遺傳時(shí)鐘來(lái)追蹤生物年齡（即基于分子標(biāo)記的年齡）的變化，并揭示了小鼠胚胎發(fā)生早期的年輕化事件。結(jié)果表明，胚胎第6.5/7.5天樣本的平均表觀遺傳年齡與胚胎發(fā)生早期階段相比始終較低，使用不同的概率時(shí)鐘（scAge）進(jìn)行單細(xì)胞分析也顯示了類(lèi)似模式。這個(gè)胚胎時(shí)期大約對(duì)應(yīng)于原腸胚形成。然而，人類(lèi)是否存在類(lèi)似的年輕化事件仍然是一個(gè)未解的問(wèn)題。為此，研究人員評(píng)估了人類(lèi)早期胚胎發(fā)生過(guò)程中的表觀遺傳年齡動(dòng)態(tài)變化。
表觀遺傳時(shí)鐘基于CpG位點(diǎn)的甲基化水平，是生物年齡的有前景的分子估計(jì)器。這些時(shí)鐘可以定量分析人類(lèi)衰老的多個(gè)方面。盡管有多種基于人類(lèi)甲基化陣列的表觀遺傳時(shí)鐘可用，但基于人類(lèi)亞硫酸鹽測(cè)序的老化時(shí)鐘尚未開(kāi)發(fā)。這可能是因?yàn)橹钡阶罱�，還沒(méi)有可用的亞硫酸鹽測(cè)序數(shù)據(jù)（具有足夠數(shù)量的年齡metadata的樣本）適合用于訓(xùn)練（training）表觀遺傳時(shí)鐘。
分析結(jié)果：
為了評(píng)估人類(lèi)胚胎發(fā)生的表觀遺傳年齡動(dòng)態(tài)變化，需要基于人類(lèi)亞硫酸鹽測(cè)序數(shù)據(jù)的表觀遺傳時(shí)鐘方法，因?yàn)橹挥羞@種類(lèi)型的數(shù)據(jù)對(duì)人類(lèi)胚胎可用（表S1）。因此開(kāi)發(fā)了一種新的表觀遺傳時(shí)鐘方法，即“交集時(shí)鐘”（圖1），并使用182個(gè)人類(lèi)血液樣本的可用簡(jiǎn)化還原性亞硫酸鹽測(cè)序（RRBS）數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練（表S1中的數(shù)據(jù)集1，圖S1）。交集時(shí)鐘針對(duì)亞硫酸鹽測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化，其中訓(xùn)練集和測(cè)試數(shù)據(jù)集之間重疊的CpG位點(diǎn)數(shù)量不足，無(wú)法進(jìn)行可靠預(yù)測(cè)。交集時(shí)鐘最大限度利用在測(cè)試樣本中沒(méi)有丟失時(shí)鐘CpG位點(diǎn)的信息性CpG位點(diǎn)。通過(guò)在訓(xùn)練數(shù)據(jù)集和測(cè)試樣本數(shù)據(jù)之間的交集CpG位點(diǎn)上進(jìn)行訓(xùn)練和測(cè)試來(lái)預(yù)測(cè)測(cè)試樣本的年齡。因此，交集時(shí)鐘方法保證在測(cè)試樣本中沒(méi)有丟失的時(shí)鐘CpG位點(diǎn)。盡管這種方法需要為每個(gè)數(shù)據(jù)集訓(xùn)練新的表觀遺傳時(shí)鐘，但它最大程度提高了這些數(shù)據(jù)集的效用。
DCM：擴(kuò)張型心肌�。籈S細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞；GW：妊娠周；HNES細(xì)胞：人類(lèi)幼稚胚胎干細(xì)胞；iPSCs：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；MII卵母細(xì)胞：中期II卵母細(xì)胞；P：通道；PSCs：多能干細(xì)胞；RRBS：減少代表性亞硫酸鹽測(cè)序；WGBS：全基因組亞硫酸鹽測(cè)序。
圖1：交集時(shí)鐘工作流程示意圖。對(duì)每個(gè)測(cè)試樣本進(jìn)行表觀遺傳年齡預(yù)測(cè)，工作流程如下：- 確定訓(xùn)練數(shù)據(jù)集和測(cè)試樣本之間CpG位點(diǎn)的交集。
- 將訓(xùn)練集和測(cè)試樣本限于交集CpG位點(diǎn)。
- 對(duì)訓(xùn)練集（交集訓(xùn)練集）和測(cè)試樣本（交集測(cè)試樣本）進(jìn)行模型的訓(xùn)練和測(cè)試。
- 對(duì)交集訓(xùn)練集進(jìn)行五次交集驗(yàn)證，產(chǎn)生了五個(gè)交集時(shí)鐘模型（例如ElasticNet模型）。
- 計(jì)算五個(gè)模型的預(yù)測(cè)結(jié)果平均值，生成樣本的預(yù)測(cè)（表觀遺傳）年齡。
補(bǔ)充圖S1：按條件、性別和年齡分列的182個(gè)訓(xùn)練樣本（人類(lèi)血液）的分布情況。為了評(píng)估胚胎發(fā)生過(guò)程中的表觀遺傳年齡動(dòng)態(tài)變化，收集可用的人類(lèi)DNA甲基化（DNAm）數(shù)據(jù)集（數(shù)據(jù)集2-4），并使用交集時(shí)鐘進(jìn)行分析。交集時(shí)鐘對(duì)僅限于交集CpG位點(diǎn)訓(xùn)練集上的交集驗(yàn)證中表現(xiàn)出高性能（圖2a-c）。數(shù)據(jù)集2中的一項(xiàng)研究使用RRBS生成了人類(lèi)植入前發(fā)育和胚胎干細(xì)胞（代表人類(lèi)外胚層）的全基因組甲基化圖。研究人員處理了包括精子、卵裂、囊胚和人類(lèi)胚胎干細(xì)胞（ES）細(xì)胞在內(nèi)的所有人類(lèi)樣本的甲基化水平，觀察到卵裂期和囊胚期胚胎的預(yù)測(cè)表觀遺傳年齡之間沒(méi)有顯著變化（p = 0.7378）；囊胚和ES細(xì)胞的表觀遺傳年齡顯著下降（p=1.582e-12）（圖2e）。小鼠外胚層（E6.5）與人類(lèi)ES細(xì)胞之間的跨物種比較表明，這些ES細(xì)胞是人類(lèi)外胚層的合理替代物；因此數(shù)據(jù)表明，人類(lèi)植入后外胚層的表觀遺傳年齡也低于植入前階段的表觀遺傳年齡。進(jìn)一步將交集時(shí)鐘應(yīng)用于另外兩個(gè)數(shù)據(jù)集（數(shù)據(jù)集3和4），其中包含植入前（受精卵、卵裂、桑椹胚和囊胚）和植入后（GW 6-11肝臟和絨毛）樣本。觀察到植入前階段之間沒(méi)有顯著變化；但植入后樣本的表觀遺傳年齡顯著下降（圖2f，g）�？偟膩�(lái)說(shuō)數(shù)據(jù)表明人類(lèi)胚胎在早期胚胎發(fā)生期間年輕化。
圖2：交集時(shí)鐘揭示人類(lèi)早期胚胎發(fā)生期間的年輕化事件。(e-g) 不同人類(lèi)發(fā)育階段樣本的平均預(yù)測(cè)年齡（表觀遺傳年齡）：圖表顯示交集時(shí)鐘對(duì)不同人類(lèi)發(fā)育階段樣本（來(lái)自Datasets2–4）的平均預(yù)測(cè)年齡。在數(shù)據(jù)集2中，ES細(xì)胞代表植入后外胚層。
(h) 圖表展示交集時(shí)鐘對(duì)健康對(duì)照組和擴(kuò)張型心肌病患者的纖維細(xì)胞及其衍生的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）（來(lái)自Dataset5）的平均預(yù)測(cè)年齡。
(j、l、n) 圖表展示交集時(shí)鐘對(duì)不同數(shù)據(jù)集（Datasets6–8）的naïve細(xì)胞（重置細(xì)胞、HNES1細(xì)胞）和primed（常規(guī)PSCs，primed HNES1細(xì)胞，代表植入后外胚層）胚胎干細(xì)胞（ESC）樣本的平均預(yù)測(cè)年齡（表觀遺傳年齡）。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證該方法分析年輕化事件的能力，將交集時(shí)鐘應(yīng)用于人類(lèi)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）數(shù)據(jù)集（Dataset 5）。結(jié)果表明，成年對(duì)照組（p=0.0136）和擴(kuò)張型心肌病患者（2.679e-05）的成纖維細(xì)胞重編程后，表觀遺傳年齡顯著下降（圖2d、h）。
數(shù)據(jù)集2-4不僅包含胚胎數(shù)據(jù)，還包括精子數(shù)據(jù)，在數(shù)據(jù)集3中還包括MII卵母細(xì)胞樣本。將交集時(shí)鐘應(yīng)用于這些樣本的甲基化譜，發(fā)現(xiàn)精子細(xì)胞的表觀遺傳年齡在某些情況下低于植入前階段：在數(shù)據(jù)集2和3中的差異顯著（圖2e、f），而在數(shù)據(jù)集4中的差異不顯著（圖2g）。此外，人類(lèi)MII卵母細(xì)胞和植入前胚胎之間的表觀遺傳年齡沒(méi)有顯著差異（圖2f），盡管精子細(xì)胞的表觀遺傳年齡顯著低于MII卵母細(xì)胞。目前尚不清楚雄性生殖細(xì)胞在配子發(fā)生過(guò)程中是否也會(huì)經(jīng)歷年輕化。
無(wú)論是來(lái)源于囊胚還是通過(guò)重編程生成的常規(guī)人類(lèi)多能干細(xì)胞（PSCs），都與小鼠胚胎干細(xì)胞不同，代表了多能性的發(fā)育晚期或啟動(dòng)階段。通過(guò)體外重置常規(guī)PSCs或直接從ICM捕獲細(xì)胞開(kāi)發(fā)了多種方法來(lái)生成更接近原始表型的PSCs。通過(guò)將交集時(shí)鐘應(yīng)用于數(shù)據(jù)集6-8，primed（代表早期植入后）和naïve（代表植入前）PSCs的表觀遺傳年齡，并觀察到在所有情況下，primed細(xì)胞的表觀遺傳年齡顯著低于naïve細(xì)胞（圖2i-n）。
總之，這些數(shù)據(jù)支持了年輕化事件發(fā)生在人類(lèi)早期胚胎發(fā)育期間的假設(shè)。
DISCUSSION
本研究結(jié)果重現(xiàn)了在小鼠中的發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)胚胎第6.5/7.5天樣本的表觀遺傳年齡與早期胚胎發(fā)生階段相比始終較低。因此，胚胎年輕化事件在小鼠和人類(lèi)之間保守，并且在兩個(gè)物種中都發(fā)生在胚胎發(fā)育的原腸胚形成階段。數(shù)據(jù)支持人類(lèi)胚胎發(fā)生過(guò)程中實(shí)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于生物體最低生物學(xué)年齡的“歸零（ground zero）”模型。隨著對(duì)“ground zero”認(rèn)識(shí)的不斷發(fā)展，可能會(huì)改變對(duì)人類(lèi)生物體生命開(kāi)始的看法。
在某些情況下，精子細(xì)胞的表觀遺傳年齡低于MII卵母細(xì)胞和植入前階段胚胎。本研究分析了胚胎年輕化，但目前尚不清楚生殖細(xì)胞發(fā)育和配子發(fā)生是否也與年輕化有關(guān)，需要進(jìn)一步研究來(lái)闡明這一點(diǎn)。
在唯一可用的潛在訓(xùn)練數(shù)據(jù)集（數(shù)據(jù)集1）中，最年長(zhǎng)的健康患者是40歲，而年長(zhǎng)患者表現(xiàn)出不良的健康表型（SA或MDD，圖S1）。盡管最初研究揭示了健康組與SA組、健康組與MDD組之間的甲基化譜存在顯著差異，但至少部分差異可能是由于健康組與SD/MDD組之間的平均年齡差異所致。同樣可能的是，區(qū)分健康組和SD/MDD組的CpG位點(diǎn)與表觀遺傳時(shí)鐘使用的CpG位點(diǎn)不同�？偟膩�(lái)說(shuō)，在這種情況下，使用所有數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練過(guò)程是合理的。
先前基于甲基化芯片的人類(lèi)iPSCs表觀遺傳年齡評(píng)估顯示，在重編程過(guò)程中表觀遺傳年齡下降（即年輕化）。本研究基于人類(lèi)亞硫酸鹽測(cè)序數(shù)據(jù)驗(yàn)證了這些結(jié)果（圖2h），并表明交集時(shí)鐘可以檢測(cè)到年輕化。
人類(lèi)胚胎的全基因組CpG甲基化在植入前發(fā)育期間從受精卵到囊胚階段逐漸減少，隨后在植入后胚胎（代表性primed PSCs）中全基因組CpG甲基化增加。相比之下，植入前發(fā)育期間（受精卵、卵裂、桑椹胚和囊胚階段；圖2e-g）表觀遺傳年齡沒(méi)有顯著變化，隨后在植入后胚胎（代表性primed PSCs）中表觀遺傳年齡下降（圖2e-g、j、l、n）。這些數(shù)據(jù)表明，DNA甲基化維持和de novo甲基化在年輕化事件中發(fā)揮作用，和之前在小鼠中的結(jié)果一致。
參考文獻(xiàn)：
Kerepesi C, Gladyshev VN. Intersection clock reveals a rejuvenation event during human embryogenesis. Aging Cell. 2023 Oct;22(10):e13922. doi: 10.1111/acel.13922. PubMed PMID: 37786333.
標(biāo)簽：
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