WGBS+ChIP-seq揭示食管癌的細(xì)胞類型和癌癥特異性表觀遺傳調(diào)控
食管癌是一種常見的惡性腫瘤，有兩種亞型：鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，ESCC）和腺癌（adenocarcinoma，EAC）。區(qū)分細(xì)胞類型特異性分子特征和癌癥特異性特征具有挑戰(zhàn)性。表觀遺傳學(xué)上，多項(xiàng)研究報(bào)告了食管癌中的分子變化，特別是在DNA甲基化水平上，食管癌的DNA甲基化組需要通過(guò)全基因組單堿基分辨率方法（如全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序，WGBS）進(jìn)行全面表征。特別是關(guān)于細(xì)胞類型和癌癥特異性差異甲基化區(qū)域（differentially methylated regions，DMRs）和部分甲基化結(jié)構(gòu)域（partially methylated domains，PMDs）的幾個(gè)重要問題尚待進(jìn)一步表征，包括：①這些結(jié)構(gòu)域的區(qū)域特異性程度（即細(xì)胞類型和癌癥特異性DMR/PMD比例）；② DMRs和PMDs在癌癥生物學(xué)中的功能意義；③ 腫瘤發(fā)生過(guò)程中DMRs和PMDs變化的潛在機(jī)制。
2023年8月23日，中山大學(xué)第七附屬醫(yī)院科研中心鄭悅媛副研究員等為第一作者，美國(guó)Samuel Oschin綜合癌癥研究所De-Chen Lin研究團(tuán)隊(duì)與以色列耶路撒冷希伯來(lái)大學(xué)Benjamin P. Berman研究團(tuán)隊(duì)為共同通訊在《Genome Biology》雜志發(fā)表題為“Comprehensive analyses of partially methylated domains and differentially methylated regions in esophageal cancer reveal both cell-type- and cancer-specific epigenetic regulation”的研究論文，對(duì)食管癌中部分甲基化結(jié)構(gòu)域和差異甲基化區(qū)域的綜合分析揭示了細(xì)胞類型和癌癥特異性的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。
標(biāo)題：Comprehensive analyses of partially methylated domains and differentially methylated regions in esophageal cancer reveal both cell-type- and cancer-specific epigenetic regulation（對(duì)食管癌部分甲基化結(jié)構(gòu)域和差異甲基化區(qū)域的綜合分析揭示了細(xì)胞類型和癌癥特異性的表觀遺傳調(diào)控）
時(shí)間：2023-8-23
期刊：Genome Biology
影響因子：12.3
技術(shù)平臺(tái)：ChIP-seq、WGBS等
研究摘要：
對(duì)21個(gè)ESCC組織、5個(gè)非惡性食管鱗狀（NESQ）組織、12個(gè)EAC/GEJ腫瘤組織和7個(gè)非惡性GEJ（NGEJ）組織在內(nèi)的兩種不同食管癌亞型及其相應(yīng)的非惡性組織，共計(jì)45例食管樣本的WGBS數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并開發(fā)一種新的sequence-aware方法鑒定大范圍的PMD，揭示腫瘤樣本中PMD甲基化水平和基因組分布的高異質(zhì)性。此外，研究鑒定出與抑制轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)B區(qū)和高體細(xì)胞突變相關(guān)的亞型特異性PMD。盡管這些PMDs的基因組位點(diǎn)在正常細(xì)胞中已經(jīng)建立，但在腫瘤中丟失程度顯著更高。H3K36me2的細(xì)胞類型特異性沉積可能是PMDs基因組分布的基礎(chǔ)。在較小的基因組范圍內(nèi)，對(duì)每個(gè)亞型鑒定出細(xì)胞類型特異性和癌癥特異性的差異甲基化區(qū)域（DMRs）。通過(guò)在這些DMRs中進(jìn)行結(jié)合motif分析，展示了細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄因子HNF4A維持了其在正常細(xì)胞中產(chǎn)生的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)在食管腺癌中與新的合作伙伴如FOSL1共同建立新的結(jié)合位點(diǎn)。最后研究人員利用泛組織單細(xì)胞和泛癌癥表觀基因組數(shù)據(jù)集進(jìn)行后期驗(yàn)證，證明食管癌中的大部分細(xì)胞類型特異性PMDs和差異甲基化區(qū)域（DMRs），實(shí)際上源于相關(guān)細(xì)胞類型的其他癌癥中共同發(fā)生的標(biāo)記物。
總之，本研究結(jié)果促進(jìn)了對(duì)正常和惡性狀態(tài)下不同基因組范圍DNA甲基化水平變化的理解，為細(xì)胞類型特異性和癌癥特異性表觀遺傳調(diào)控提供了新的機(jī)制性見解。
研究結(jié)果：
（1）開發(fā)新的sequence-aware calling方法來(lái)鑒定PMD
研究人員基于MethylSeekR中使用的Hidden Markov模型（HMM）開發(fā)了一種sequence-aware PMD的calling方法，命名為MMSeekR（Multi-model PMD SeekR）。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，MMSeekR成功地在所有樣本中一致地鑒定出PMDs，并具有高穩(wěn)定性和一致性。且MMSeekR幾乎可以完全分離不同癌癥類型。
圖1：通過(guò)sequence-aware的多模型PMD calling鑒定食管樣品中的PMD（MMSeekR）
A. 本研究設(shè)計(jì)的圖形模型。
B. 點(diǎn)圖顯示全基因組中所有CpG、CGI啟動(dòng)子內(nèi)CpG、PMDs、SINE、LINE和LTR在不同樣本中的平均甲基化水平。
C. 開發(fā)新的PMD calling方法。MethylSeekR α評(píng)分檢測(cè)了全基因組中201個(gè)連續(xù)CpG的滑動(dòng)窗口中甲基化水平分布。α得分<1對(duì)應(yīng)于向高或低甲基化水平的極化分布（即HMDs），而α得分≥1對(duì)應(yīng)于向中間甲基化水平分布（即PMD）。PCC顯示基于NN模型預(yù)測(cè)低甲基化評(píng)分與實(shí)際甲基化水平之間的相關(guān)性。強(qiáng)負(fù)相關(guān)表示有利于PMD的區(qū)域，而弱/零相關(guān)則有利于HMD。
D. 使用三種PMD calling方法的前5000個(gè)可變30 kb tiles對(duì)45個(gè)食管樣本進(jìn)行PCA分析。
E-F. 代表性窗口顯示MMSeekR成功鑒定PMD，但MethPipe（E）或MethylSeekR（F）均未檢測(cè)到PMD
（2）食管樣本中共有和亞型特異性PMD表征
圖2：共有和亞型特異性PMD表征
A. 45個(gè)食管樣品的DNA甲基化譜的代表性窗口。平均甲基化值顯示在連續(xù)且不重疊的10 kb tiles中。
B. 基于兩種食管癌類型的頻率和重疊，鑒定出PMD類別。
C. 線圖顯示食管腫瘤中不同PMD類別的平均甲基化水平，其中每條線代表一個(gè)樣本。
D. 使用TCGA甲基化數(shù)據(jù)集觀察到類似的線圖模式，顯示樣品間的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。下面熱圖中的每一行都表示一個(gè)單獨(dú)樣本。
E. 條形圖顯示W(wǎng)GBS PMD與染色質(zhì)B區(qū)室重疊的百分比。D和E中的甲基化數(shù)據(jù)集來(lái)自TCGA ESCA HM450k芯片，包括91個(gè)ESCC和75個(gè)EAC樣品。
F. 基于WGS的體細(xì)胞突變率，分別針對(duì)每個(gè)WGBS PMD類別計(jì)算突變率。EAC WGS數(shù)據(jù)集：276個(gè)樣本；ESCC WGS數(shù)據(jù)集：508個(gè)樣本
C-D. 使用EAC特異性（C）或ESCC特異性（D）PMD及其下調(diào)基因的Cistrome-GO富集分析。顯示了最顯著的前15個(gè)條通路，右側(cè)顯示了每個(gè)通路中富集的基因數(shù)量。
E. EAC特異性（左圖）和ESCC特異性PMD（右圖）的甲基化譜代表性基因組窗口。
F. 火山圖顯示位于E基因組結(jié)構(gòu)域內(nèi)基因在相應(yīng)癌癥亞型中下調(diào)。用平均表達(dá)水平（FPKM）鑒定差異表達(dá)基因，F(xiàn)PKM≥0.1，調(diào)整后的p<0.05和絕對(duì)倍數(shù)變化>2。
C、D、F中的表達(dá)RNA-seq來(lái)自TCGA ESCA項(xiàng)目，包括76個(gè)ESCC和78個(gè)EAC樣品
（3）H3K36me2以細(xì)胞類型特異性方式與PMD呈負(fù)相關(guān)
B. 代表性基因組位點(diǎn)顯示ChIP-seq的H3K36me2信號(hào)，以及WGBS數(shù)據(jù)的亞型特異性PMD。
C. 四種不同PMD類別的HNSCC細(xì)胞系中H3K36me2 ChIP-seq水平的聚合圖。H3K36me2 ChIP-seq數(shù)據(jù)集獲自GSE149670。A、C中的H3K36me2信號(hào)通過(guò)5kb窗口中IP與Input的CPM比進(jìn)行歸一化
（4）食管癌中的亞型特異性差異甲基化區(qū)域（DMR）
B. 密度圖顯示hypoDMR的大小分布；堆疊條形圖顯示與不同基因組特征重疊的hypoDMR比例。
C-D. EAC（C）或ESCC（D）hypoDMR或隨機(jī)基因組區(qū)域（背景）內(nèi)的ATAC-seq信號(hào)的聚合圖，這些區(qū)域包含了10個(gè)隨機(jī)選擇的具有相同CpG密度區(qū)域。ATAC-seq信號(hào)來(lái)自TCGA，并用CPM方法進(jìn)行歸一化。
E-F. EAC（E）或ESCC（F）hypoDMR及其相應(yīng)亞型中上調(diào)基因進(jìn)行Cistrome-GO富集分析。顯示了最顯著的前15條通路。每條通路中富集的基因數(shù)量顯示在右側(cè)。表達(dá)數(shù)據(jù)集來(lái)自TCGA ESCA項(xiàng)目。
G-H. ELMER方法鑒定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合motif，以EAC（G）或ESCC（H）hypoDMR為前景，隨機(jī)區(qū)域?yàn)楸尘啊F家族的注釋來(lái)自TFClass數(shù)據(jù)庫(kù)。
I-J. 在匹配的細(xì)胞系中通過(guò)ChIP-seq、H3K27ac ChIP-seq和WGBS在EAC（GATA4）（I）和ESCC（TP63）（J）中最強(qiáng)富集TFs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。左側(cè)顯示與亞型hypoDMR重疊peaks；重疊peaks百分比在柱狀圖中表示。左上角餅圖表示所有與亞型hypoDMR重疊peaks中具有TF結(jié)合motif的peaks比例。
（5）腫瘤特異性hypoDMR的鑒定
B. 堆疊條形圖顯示與不同基因組特征重疊的ts hypoDMR比例。
C-D. EAC（C）或ESCC（D）ts-hypoDMRs及其各自亞型中與相應(yīng)非惡性樣本相比上調(diào)的基因進(jìn)行Cistrome-GO富集分析。顯示了最顯著的前15條通路。食管癌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)自TCGA和GSE149609。
E. 散點(diǎn)圖顯示與cts-hypoDMR相比，EAC ts-hypoDMR中富集的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。X軸表示EAC和匹配的非惡性GEJ樣品之間的表達(dá)倍數(shù)變化。Y軸顯示EAC ts和cts hypoDMR之間轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的δ富集評(píng)分。表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)自TCGA，motif富集分析通過(guò)ELMER方法進(jìn)行。
F. EAC ts-hypoDMRs中包含的HNF4A識(shí)別motif顯著多于cts-hypoDMRs。
G. 與cts-hypoDMRs相比，更多的HNF4A peaks與ts-hypoDMRs重疊。peak來(lái)自ESO26（GSE132813）和OE19細(xì)胞系的HNF4A ChIP-seq。
H. HNF4A在ts-hypoDMRs中與AP-1家族共有，而在cts-hypoDMRs中與FOXA1/2共有。
I. 在ESO26和OE19細(xì)胞系中，使用qPCR實(shí)驗(yàn)分析scramble shRNA與shHNF4A組中HNF4A mRNA表達(dá)。
J-K. scramble shRNA或shHNF4A組在ESO26（J）和OE19（K）細(xì)胞中進(jìn)行 FOSL1 ChIP-qPCR分析。IgG用作陰性對(duì)照抗體。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。p值通過(guò)雙側(cè)t檢驗(yàn)確定***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05；ns，不顯著；nd，不可檢測(cè)
（6）PMD和hypoDMR表現(xiàn)出強(qiáng)細(xì)胞類型特異性表觀基因組特征
B. 非惡性食管樣品中不同PMD的平均甲基化水平火山圖。通過(guò)雙尾t檢驗(yàn)確定了具有顯著差異的區(qū)域，F(xiàn)DR截止值<0.1。
C. 不同hypoDMR類別在兩種非惡性食管樣本中的平均甲基化水平線圖。
D. 非惡性食管樣品中不同hypoDMR類別的平均甲基化水平火山圖。
E. UMAP圖顯示細(xì)胞簇（左），ESCC與EAC特異性PMD（中）或ESCC與EAC特異性hypoDMR（右）中的ATAC-seq水平。
F-G. 點(diǎn)圖顯示在樣本水平上，ESCC與EAC的特異性PMD（F）或ESCC與EAC的特異性hypoDMR（G）中的ATAC-seq值
（7）亞型特異性PMD和hypoDMR的泛癌分析
D-E. 分別對(duì)B和C中的甲基化差異進(jìn)行點(diǎn)圖定量。
F. t-SNE圖顯示癌癥類型簇。
G-H. 腫瘤樣本中ESCC與EAC特異性PMD（G）以及ESCC與EAC特異性hypoDMR（H）中的ATAC-seq水平。
I-M. 點(diǎn)圖分別以G和H表示ATAC-seq值的量化。K–M精度召回曲線分別表示亞型特異性PMD（K）、DMR（L）或兩者（M）的平均甲基化。
研究小結(jié)
本研究強(qiáng)調(diào)了正常細(xì)胞類型中存在細(xì)胞類型特異性的PMDs和DMRs，這些細(xì)胞類型在惡性細(xì)胞中得以保留。本研究是首次展示PMDs在正常、前體和惡性狀態(tài)下的顯著細(xì)胞類型特異性。雖然先前的研究表明DMRs包含組織特異性的調(diào)控區(qū)域，但本研究提出了一種區(qū)分細(xì)胞類型特異性與癌癥特異性區(qū)域的方法，并利用這些方法來(lái)鑒定腫瘤特異性的調(diào)控機(jī)制。
通過(guò)區(qū)分細(xì)胞類型特異性和癌癥特異性的表觀遺傳區(qū)域，研究人員能夠更深入地理解腫瘤的調(diào)控機(jī)制，這對(duì)于癌癥的診斷、治療和預(yù)防具有重要意義。
參考文獻(xiàn)：
Zheng Y, Ziman B, Ho AS, Sinha UK, Xu LY, Li EM, Koeffler HP, Berman BP, Lin DC. Comprehensive analyses of partially methylated domains and differentially methylated regions in esophageal cancer reveal both cell-type- and cancer-specific epigenetic regulation. Genome Biol. 2023 Aug 24;24(1):193. pii: 10.1186/s13059-023-03035-3. doi: 10.1186/s13059-023-03035-3. PubMed PMID: 37620896.
2023年8月23日，中山大學(xué)第七附屬醫(yī)院科研中心鄭悅媛副研究員等為第一作者，美國(guó)Samuel Oschin綜合癌癥研究所De-Chen Lin研究團(tuán)隊(duì)與以色列耶路撒冷希伯來(lái)大學(xué)Benjamin P. Berman研究團(tuán)隊(duì)為共同通訊在《Genome Biology》雜志發(fā)表題為“Comprehensive analyses of partially methylated domains and differentially methylated regions in esophageal cancer reveal both cell-type- and cancer-specific epigenetic regulation”的研究論文，對(duì)食管癌中部分甲基化結(jié)構(gòu)域和差異甲基化區(qū)域的綜合分析揭示了細(xì)胞類型和癌癥特異性的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。
標(biāo)題：Comprehensive analyses of partially methylated domains and differentially methylated regions in esophageal cancer reveal both cell-type- and cancer-specific epigenetic regulation（對(duì)食管癌部分甲基化結(jié)構(gòu)域和差異甲基化區(qū)域的綜合分析揭示了細(xì)胞類型和癌癥特異性的表觀遺傳調(diào)控）
時(shí)間：2023-8-23
期刊：Genome Biology
影響因子：12.3
技術(shù)平臺(tái)：ChIP-seq、WGBS等
研究摘要：
對(duì)21個(gè)ESCC組織、5個(gè)非惡性食管鱗狀（NESQ）組織、12個(gè)EAC/GEJ腫瘤組織和7個(gè)非惡性GEJ（NGEJ）組織在內(nèi)的兩種不同食管癌亞型及其相應(yīng)的非惡性組織，共計(jì)45例食管樣本的WGBS數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并開發(fā)一種新的sequence-aware方法鑒定大范圍的PMD，揭示腫瘤樣本中PMD甲基化水平和基因組分布的高異質(zhì)性。此外，研究鑒定出與抑制轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)B區(qū)和高體細(xì)胞突變相關(guān)的亞型特異性PMD。盡管這些PMDs的基因組位點(diǎn)在正常細(xì)胞中已經(jīng)建立，但在腫瘤中丟失程度顯著更高。H3K36me2的細(xì)胞類型特異性沉積可能是PMDs基因組分布的基礎(chǔ)。在較小的基因組范圍內(nèi)，對(duì)每個(gè)亞型鑒定出細(xì)胞類型特異性和癌癥特異性的差異甲基化區(qū)域（DMRs）。通過(guò)在這些DMRs中進(jìn)行結(jié)合motif分析，展示了細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄因子HNF4A維持了其在正常細(xì)胞中產(chǎn)生的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)在食管腺癌中與新的合作伙伴如FOSL1共同建立新的結(jié)合位點(diǎn)。最后研究人員利用泛組織單細(xì)胞和泛癌癥表觀基因組數(shù)據(jù)集進(jìn)行后期驗(yàn)證，證明食管癌中的大部分細(xì)胞類型特異性PMDs和差異甲基化區(qū)域（DMRs），實(shí)際上源于相關(guān)細(xì)胞類型的其他癌癥中共同發(fā)生的標(biāo)記物。
總之，本研究結(jié)果促進(jìn)了對(duì)正常和惡性狀態(tài)下不同基因組范圍DNA甲基化水平變化的理解，為細(xì)胞類型特異性和癌癥特異性表觀遺傳調(diào)控提供了新的機(jī)制性見解。
研究結(jié)果：
（1）開發(fā)新的sequence-aware calling方法來(lái)鑒定PMD
研究人員基于MethylSeekR中使用的Hidden Markov模型（HMM）開發(fā)了一種sequence-aware PMD的calling方法，命名為MMSeekR（Multi-model PMD SeekR）。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，MMSeekR成功地在所有樣本中一致地鑒定出PMDs，并具有高穩(wěn)定性和一致性。且MMSeekR幾乎可以完全分離不同癌癥類型。
圖1：通過(guò)sequence-aware的多模型PMD calling鑒定食管樣品中的PMD（MMSeekR）
A. 本研究設(shè)計(jì)的圖形模型。
B. 點(diǎn)圖顯示全基因組中所有CpG、CGI啟動(dòng)子內(nèi)CpG、PMDs、SINE、LINE和LTR在不同樣本中的平均甲基化水平。
C. 開發(fā)新的PMD calling方法。MethylSeekR α評(píng)分檢測(cè)了全基因組中201個(gè)連續(xù)CpG的滑動(dòng)窗口中甲基化水平分布。α得分<1對(duì)應(yīng)于向高或低甲基化水平的極化分布（即HMDs），而α得分≥1對(duì)應(yīng)于向中間甲基化水平分布（即PMD）。PCC顯示基于NN模型預(yù)測(cè)低甲基化評(píng)分與實(shí)際甲基化水平之間的相關(guān)性。強(qiáng)負(fù)相關(guān)表示有利于PMD的區(qū)域，而弱/零相關(guān)則有利于HMD。
D. 使用三種PMD calling方法的前5000個(gè)可變30 kb tiles對(duì)45個(gè)食管樣本進(jìn)行PCA分析。
E-F. 代表性窗口顯示MMSeekR成功鑒定PMD，但MethPipe（E）或MethylSeekR（F）均未檢測(cè)到PMD
（2）食管樣本中共有和亞型特異性PMD表征
圖2：共有和亞型特異性PMD表征
B. 基于兩種食管癌類型的頻率和重疊，鑒定出PMD類別。
C. 線圖顯示食管腫瘤中不同PMD類別的平均甲基化水平，其中每條線代表一個(gè)樣本。
D. 使用TCGA甲基化數(shù)據(jù)集觀察到類似的線圖模式，顯示樣品間的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。下面熱圖中的每一行都表示一個(gè)單獨(dú)樣本。
E. 條形圖顯示W(wǎng)GBS PMD與染色質(zhì)B區(qū)室重疊的百分比。D和E中的甲基化數(shù)據(jù)集來(lái)自TCGA ESCA HM450k芯片，包括91個(gè)ESCC和75個(gè)EAC樣品。
F. 基于WGS的體細(xì)胞突變率，分別針對(duì)每個(gè)WGBS PMD類別計(jì)算突變率。EAC WGS數(shù)據(jù)集：276個(gè)樣本；ESCC WGS數(shù)據(jù)集：508個(gè)樣本
圖3：亞型特異性PMD調(diào)控細(xì)胞類型的特異性功能
A-B. 在EAC（A）和ESCC（B）中，PMD覆蓋基因表達(dá)水平與非PMD呈癌癥特異性方式降低。C-D. 使用EAC特異性（C）或ESCC特異性（D）PMD及其下調(diào)基因的Cistrome-GO富集分析。顯示了最顯著的前15個(gè)條通路，右側(cè)顯示了每個(gè)通路中富集的基因數(shù)量。
E. EAC特異性（左圖）和ESCC特異性PMD（右圖）的甲基化譜代表性基因組窗口。
F. 火山圖顯示位于E基因組結(jié)構(gòu)域內(nèi)基因在相應(yīng)癌癥亞型中下調(diào)。用平均表達(dá)水平（FPKM）鑒定差異表達(dá)基因，F(xiàn)PKM≥0.1，調(diào)整后的p<0.05和絕對(duì)倍數(shù)變化>2。
C、D、F中的表達(dá)RNA-seq來(lái)自TCGA ESCA項(xiàng)目，包括76個(gè)ESCC和78個(gè)EAC樣品
（3）H3K36me2以細(xì)胞類型特異性方式與PMD呈負(fù)相關(guān)
圖4：H3K36me2標(biāo)記與PMD呈細(xì)胞類型特異性負(fù)相關(guān)
A. 食管癌細(xì)胞系中H3K36me2 ChIP-seq水平在四種不同PMD類別中的聚合圖：共有PMD、EAC特異性PMD、ESCC特異性PMD、共有HMD。B. 代表性基因組位點(diǎn)顯示ChIP-seq的H3K36me2信號(hào)，以及WGBS數(shù)據(jù)的亞型特異性PMD。
C. 四種不同PMD類別的HNSCC細(xì)胞系中H3K36me2 ChIP-seq水平的聚合圖。H3K36me2 ChIP-seq數(shù)據(jù)集獲自GSE149670。A、C中的H3K36me2信號(hào)通過(guò)5kb窗口中IP與Input的CPM比進(jìn)行歸一化
（4）食管癌中的亞型特異性差異甲基化區(qū)域（DMR）
圖5：食管癌中的亞型特異性DMRs
A. 比較EAC和ESCC腫瘤，鑒定出癌癥hypoDMR。FDR<0.05和絕對(duì)δ甲基化水平>0.2區(qū)域被識(shí)別為DMRs。B. 密度圖顯示hypoDMR的大小分布；堆疊條形圖顯示與不同基因組特征重疊的hypoDMR比例。
C-D. EAC（C）或ESCC（D）hypoDMR或隨機(jī)基因組區(qū)域（背景）內(nèi)的ATAC-seq信號(hào)的聚合圖，這些區(qū)域包含了10個(gè)隨機(jī)選擇的具有相同CpG密度區(qū)域。ATAC-seq信號(hào)來(lái)自TCGA，并用CPM方法進(jìn)行歸一化。
E-F. EAC（E）或ESCC（F）hypoDMR及其相應(yīng)亞型中上調(diào)基因進(jìn)行Cistrome-GO富集分析。顯示了最顯著的前15條通路。每條通路中富集的基因數(shù)量顯示在右側(cè)。表達(dá)數(shù)據(jù)集來(lái)自TCGA ESCA項(xiàng)目。
G-H. ELMER方法鑒定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合motif，以EAC（G）或ESCC（H）hypoDMR為前景，隨機(jī)區(qū)域?yàn)楸尘啊F家族的注釋來(lái)自TFClass數(shù)據(jù)庫(kù)。
I-J. 在匹配的細(xì)胞系中通過(guò)ChIP-seq、H3K27ac ChIP-seq和WGBS在EAC（GATA4）（I）和ESCC（TP63）（J）中最強(qiáng)富集TFs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。左側(cè)顯示與亞型hypoDMR重疊peaks；重疊peaks百分比在柱狀圖中表示。左上角餅圖表示所有與亞型hypoDMR重疊peaks中具有TF結(jié)合motif的peaks比例。
（5）腫瘤特異性hypoDMR的鑒定
圖6：腫瘤特異性低甲基化差異甲基化區(qū)域（hypoDMRs）的鑒定
A. 每個(gè)EAC hypoDMR的DNA甲基化水平熱圖。每列表示一個(gè)樣本，行按EAC和NGEJ之間的delta平均甲基化排序（左）。在EAC腫瘤和NGEJ樣本（右）之間使用FDR截止值的單尾t檢驗(yàn)鑒定EAC ts hypoDMR<0.05。B. 堆疊條形圖顯示與不同基因組特征重疊的ts hypoDMR比例。
C-D. EAC（C）或ESCC（D）ts-hypoDMRs及其各自亞型中與相應(yīng)非惡性樣本相比上調(diào)的基因進(jìn)行Cistrome-GO富集分析。顯示了最顯著的前15條通路。食管癌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)自TCGA和GSE149609。
E. 散點(diǎn)圖顯示與cts-hypoDMR相比，EAC ts-hypoDMR中富集的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。X軸表示EAC和匹配的非惡性GEJ樣品之間的表達(dá)倍數(shù)變化。Y軸顯示EAC ts和cts hypoDMR之間轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的δ富集評(píng)分。表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)自TCGA，motif富集分析通過(guò)ELMER方法進(jìn)行。
F. EAC ts-hypoDMRs中包含的HNF4A識(shí)別motif顯著多于cts-hypoDMRs。
G. 與cts-hypoDMRs相比，更多的HNF4A peaks與ts-hypoDMRs重疊。peak來(lái)自ESO26（GSE132813）和OE19細(xì)胞系的HNF4A ChIP-seq。
H. HNF4A在ts-hypoDMRs中與AP-1家族共有，而在cts-hypoDMRs中與FOXA1/2共有。
I. 在ESO26和OE19細(xì)胞系中，使用qPCR實(shí)驗(yàn)分析scramble shRNA與shHNF4A組中HNF4A mRNA表達(dá)。
J-K. scramble shRNA或shHNF4A組在ESO26（J）和OE19（K）細(xì)胞中進(jìn)行 FOSL1 ChIP-qPCR分析。IgG用作陰性對(duì)照抗體。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。p值通過(guò)雙側(cè)t檢驗(yàn)確定***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05；ns，不顯著；nd，不可檢測(cè)
（6）PMD和hypoDMR表現(xiàn)出強(qiáng)細(xì)胞類型特異性表觀基因組特征
圖7：PMD和hypoDMR表現(xiàn)出強(qiáng)細(xì)胞類型特異性表觀基因組特征
A. 不同PMD在兩種非惡性食管樣本中的平均甲基化水平線圖，非惡性樣本中的這些變化與腫瘤中變化相似（圖2C）。B. 非惡性食管樣品中不同PMD的平均甲基化水平火山圖。通過(guò)雙尾t檢驗(yàn)確定了具有顯著差異的區(qū)域，F(xiàn)DR截止值<0.1。
C. 不同hypoDMR類別在兩種非惡性食管樣本中的平均甲基化水平線圖。
D. 非惡性食管樣品中不同hypoDMR類別的平均甲基化水平火山圖。
E. UMAP圖顯示細(xì)胞簇（左），ESCC與EAC特異性PMD（中）或ESCC與EAC特異性hypoDMR（右）中的ATAC-seq水平。
F-G. 點(diǎn)圖顯示在樣本水平上，ESCC與EAC的特異性PMD（F）或ESCC與EAC的特異性hypoDMR（G）中的ATAC-seq值
（7）亞型特異性PMD和hypoDMR的泛癌分析
圖8：泛癌數(shù)據(jù)集中PMD和hypoDMR分析
A–C. TCGA腫瘤譜顯示癌癥類型簇（A）、ESCC與EAC特異性PMD（B）和ESCC與EAC特異性hypoDMR（C）中的DNA甲基化水平。A基于TCGA的聚類方案表示泛胃腸道癌（COAD、READ、STAD和EAC）和泛鱗狀細(xì)胞癌（ESCC、HNSC、LUSC以及CESC和BLCA的子集）。樣本數(shù)量為8915。D-E. 分別對(duì)B和C中的甲基化差異進(jìn)行點(diǎn)圖定量。
F. t-SNE圖顯示癌癥類型簇。
G-H. 腫瘤樣本中ESCC與EAC特異性PMD（G）以及ESCC與EAC特異性hypoDMR（H）中的ATAC-seq水平。
I-M. 點(diǎn)圖分別以G和H表示ATAC-seq值的量化。K–M精度召回曲線分別表示亞型特異性PMD（K）、DMR（L）或兩者（M）的平均甲基化。
研究小結(jié)
本研究強(qiáng)調(diào)了正常細(xì)胞類型中存在細(xì)胞類型特異性的PMDs和DMRs，這些細(xì)胞類型在惡性細(xì)胞中得以保留。本研究是首次展示PMDs在正常、前體和惡性狀態(tài)下的顯著細(xì)胞類型特異性。雖然先前的研究表明DMRs包含組織特異性的調(diào)控區(qū)域，但本研究提出了一種區(qū)分細(xì)胞類型特異性與癌癥特異性區(qū)域的方法，并利用這些方法來(lái)鑒定腫瘤特異性的調(diào)控機(jī)制。
通過(guò)區(qū)分細(xì)胞類型特異性和癌癥特異性的表觀遺傳區(qū)域，研究人員能夠更深入地理解腫瘤的調(diào)控機(jī)制，這對(duì)于癌癥的診斷、治療和預(yù)防具有重要意義。
參考文獻(xiàn)：
Zheng Y, Ziman B, Ho AS, Sinha UK, Xu LY, Li EM, Koeffler HP, Berman BP, Lin DC. Comprehensive analyses of partially methylated domains and differentially methylated regions in esophageal cancer reveal both cell-type- and cancer-specific epigenetic regulation. Genome Biol. 2023 Aug 24;24(1):193. pii: 10.1186/s13059-023-03035-3. doi: 10.1186/s13059-023-03035-3. PubMed PMID: 37620896.
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