2024年2月15日，吉林大學(xué)張濤、趙飛宇、李金澤為共同第一作者，吉林大學(xué)李占軍、隋婷婷及賴良學(xué)為共同通訊在《Nucleic Acids Research》（NAR/ IF14.9）發(fā)表題為“Programmable RNA 5-methylcytosine (m5C) modification of cellular RNAs by dCasRx conjugated methyltransferase and demethylase”的研究論文，通過m5C RNA-BS等分析揭示RCMS（reengineered m5C modification system）編輯系統(tǒng)能夠精確地在特定RNA位點摻入或去除m5C修飾，改變細胞轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性。此外，RCMS編輯系統(tǒng)還調(diào)控tRNA m5C水平，影響細胞的轉(zhuǎn)錄本豐度、細胞增殖和遷移能力。


標題：Programmable RNA 5-methylcytosine (m5C) modification of cellular RNAs by dCasRx conjugated methyltransferase and demethylase（通過dCasRx偶聯(lián)的甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶實現(xiàn)細胞RNA的可編程m5C修飾）
時間：2024.2.15
期刊：Nucleic Acids Research（核酸研究）
影響因子：IF 14.9
實驗方法：RT-qPCR、Western blot、流式細胞術(shù)、mRNA BS-seq、免疫熒光顯微鏡和RNA衰變實驗等

研究摘要：
5-甲基胞嘧啶（m5C）是一種豐富的RNA修飾，在調(diào)控RNA命運和基因表達中起著至關(guān)重要的作用。盡管最近在理解m5C的生物學(xué)作用方面取得了進展，但無法在轉(zhuǎn)錄本中的特異性位點引入m5C阻礙了揭示特異性m5C與表型結(jié)果之間直接聯(lián)系的研究。本研究作者開發(fā)了一種基于CRISPR-Cas13d的編輯系統(tǒng)，名為重編程m5C修飾系統(tǒng)（reengineered m5C modification system，簡稱RCMS），用于特定轉(zhuǎn)錄本中的靶向m5C甲基化和去甲基化。RCMS編輯系統(tǒng)由核定位的dCasRx與甲基轉(zhuǎn)移酶（NSUN2/NSUN6）或去甲基化酶（小鼠Tet2的催化結(jié)構(gòu)域）（ten-eleven translocation 2，TET-2）結(jié)合而成，可以在精確m5C位點操縱甲基化事件。研究揭示了RCMS編輯系統(tǒng)可以誘導(dǎo)特異性m5C甲基化和去甲基化。此外研究還證實了RCMS編輯系統(tǒng)在調(diào)控轉(zhuǎn)運RNA m5C水平以及通過m5C介導(dǎo)的機制誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄本豐度和細胞增殖變化的能力。研究結(jié)果共同將RCMS編輯系統(tǒng)確立為一種靶向表觀轉(zhuǎn)錄組編輯工具，有助于鑒定單基因m5C變化及其可能產(chǎn)生結(jié)果。對于深入理解RNA修飾在生物學(xué)過程中的作用以及開發(fā)新的治療策略具有重要意義。

圖形摘要

研究結(jié)果：
（1）可編程m5C編輯系統(tǒng)設(shè)計

• NSUN6酶驗證可編程位點特異性m5C writer活性

圖1：NSUN6在HEK293T細胞中驗證可編程位點特異性m5C writer活性。

A. 將NSUN6甲基轉(zhuǎn)移酶與dCasRx結(jié)合以構(gòu)建RCMS-dCasRx-NSUN6編輯器。
B. RCMS策略。該策略涉及使用與NSUN6甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合的可編程RNA結(jié)合蛋白，如dCasRx，通過靶轉(zhuǎn)錄本中特定gRNA方式，誘導(dǎo)從C到m5C的位點特異性甲基化。
C. RPSA mRNA中m5C位點和gRNA靶向區(qū)域示意圖。
D. 通過RT-qPCR使用CasRx評估RPSA gRNA的靶向效率（n=3）。
E. 使用HiTOM深度序列分析評估RCMS dCasRx-NSUN6編輯器靶向m5C甲基化后RPSA m5C位點的m5C比率水平（n=3）。
F. 在HEK293T細胞中，使用與非靶向gRNA或RPSA gRNA結(jié)合的dCasRx-NSUN6或dCasRx-dNSUN6評估RPSA mRNA水平（n=3）。
G. 用dCasRx-NSUN6或dCasRx-dNSUN6聯(lián)合非靶向gRNA或RPSA gRNA分析HEK293T細胞中RPSA的蛋白水平。
H. 在用10 mg/ml放線菌素D（一種有效的轉(zhuǎn)錄抑制劑）處理的HEK293T細胞中，通過RT-qPCR檢查指定時間點的RPSA水平（n = 3）。

“非靶向gRNA”被用作非靶向?qū)φ铡Ｕ`差線表示平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n.s.表示雙尾不成對雙樣本t檢驗不顯著。
 

• dCasRx-NSUN2在人類細胞中對內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本的甲基化

圖2：dCasRx-NSUN2在人類細胞中對內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本的甲基化。

A. 將NSUN2甲基轉(zhuǎn)移酶分別與dCasRx結(jié)合以生成RCMS dCasRx-NSUN2編輯器。
B. 提出帶有NSUN2的dCasRx RCMSs策略。
C. 展示KAT7 mRNA中m5C位點和gRNA靶向區(qū)域示意圖。
D. RT-qPCR檢測KAT7 gRNA使用CasRx的靶向效率（n=3）。
E. 通過RCMS dCasRx-NSUN2編輯器對靶向m5C甲基化后KAT7 m5C位點的C-to-T突變率進行定量，每個條形圖上方顯示總測試數(shù)[dCasRx-Tet2 CD+非靶向gRNA（6/17），dCasRx-Tet2 CD+KAT7 gRNA（15/29），dCasRx-Tet2 CD+KAT7 gRNA（10/29）；n1/n2，n1表示胞嘧啶數(shù)量，n2表示總測試數(shù)。
F. HEK293T細胞中，使用與非靶向gRNA或KAT7 gRNA結(jié)合的dCasRx-NSUN2分析KAT7 mRNA水平（n=3）。
G. 用dCasRx-NSUN2或dCasRx-dNSUN2聯(lián)合非靶向gRNA或KAT7 gRNA評估HEK293T細胞中KAT7的蛋白水平。
H. 在用10 mg/ml放線菌素D（一種強效的轉(zhuǎn)錄抑制劑）處理的HEK293T細胞中，通過RT-qPCR分析指定時間點的KAT7 mRNA水平（n = 3）。

“非靶向gRNA”用于非靶向。誤差線表示平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n.s.表示雙尾不成對雙樣本t檢驗（n=3）不顯著。
 

• 通過Tet2驗證可編程位點特異性m5C eraser活力

圖3：通過RCMS eraser dCasRx-Tet2 CD進行mRNA轉(zhuǎn)錄本的靶向去甲基化。

A. 將Tet2 CD（Tet2催化域）分別與dCasRx結(jié)合以生成RCMS dCasRx-Tet2 CD編輯器。
B. 提出帶有Tet2 CD的dCasRx RCMSs策略。
C. TRAF7（腫瘤壞死因子TNF受體相關(guān)因子7）mRNA m5C位點和gRNA靶向區(qū)域示意圖。
D. 通過RT-qPCR檢測TRAF7 gRNA的CasRx靶向效率（n=3）。
E. 通過RCMS dCasRx-Tet2 CD編輯器靶向m5C甲基化后，對TRAF7 m5C位點的C-T突變比率進行定量檢測，測試數(shù)字顯示在每個條形圖上方。dCasRx-Tet2 CD+非靶向gRNA（13/21），dCasRx-Tet2 CD+TRAF7 gRNA（10/19），dCasRx-Tet2 CD+TRAF7 gRNA（12/19）；n1/n2，n1表示胞嘧啶數(shù)量，n2表示總檢測數(shù)。
F. 使用與TRAF7 gRNA或非靶向gRNA結(jié)合的dCasRx-Tet2 CD分析TRAF7 mRNA水平（n = 3）。
G. 用dCasRx-Tet2 CD聯(lián)合TRAF7 gRNA或非靶向gRNA檢測HEK293T細胞中TRAF7的蛋白水平。
H. 在用10 mg/ml放線菌素D處理的HEK293T細胞中，通過RT-qPCR檢測指定時間點的TRAF7 mRNA水平（n = 3）。
I. BBS4 （Bardet-Biedl綜合征4）mRNA中m5C位點和gRNA靶向區(qū)域示意圖。
J. 使用RT-qPCR檢測BBS4 gRNA使用CasRx的靶向效率（n = 3）。
K. 使用HiTOM分析深度序列對dCasRx-Tet2CD編輯器靶向m5C甲基化后BBS4 m5C位點的m5C比率定量檢測（n = 3）
L. 在HEK293T細胞中，使用與BBS4 gRNA或非靶向gRNA結(jié)合的dCasRx-Tet2CD分析BBS4 mRNA水平（n = 3）。
M. 用dCasRx-Tet2CD聯(lián)合BBS4 gRNA或非靶向gRNA評估HEK293T細胞中BBS4的蛋白水平。
N. RT-qPCR檢測10 mg/ml放線菌素D處理的HEK293T細胞在指定時間點的BBS4 mRNA水平（n=3）。

（2）RCMS在tRNA中誘導(dǎo)可編程位點特異性m5C水平

圖4：HEK293T細胞中靶向處理tRNA轉(zhuǎn)錄本甲基化和去甲基化。

A. NSUN2-/-細胞系構(gòu)建示意圖。首先用編碼BE4max編輯器和靶向NSUN2基因的gRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細胞。轉(zhuǎn)染后，將細胞稀釋并接種到96孔板中進行克隆選擇，并篩選單克隆細胞的所需NSUN2-/-基因型。
B. Gln11中NSUN2-/-細胞系的Sanger測序色譜圖。
C. NSUN2-/-細胞系中NSUN2 mRNA水平（n = 3）。
D. WT細胞和NSUN2-/-細胞中NSUN2蛋白表達的Western blot結(jié)果。
E. 人tRNA^Val示意圖，tRNA^Val中三個m5C位點用紅色箭頭標記。
F. tRNA^Val中g(shù)RNA位點示意圖。
G-I.  使用dCasRx-NSUN2編輯器在NSUN2-/-細胞系中靶向m5C甲基化后，利用深度序列HiTOM分析tRNA^Val的m5C38、m5C48和m5C49位點的m5C比率（n=3）。
J-L.  使用dCasRx-Tet2 CD編輯器在HEK293T細胞中靶向m5C甲基化后，利用深度序列HiTOM分析tRNA^Val的m5C38、m5C48和m5C49位點的m5C比率（n=3）。
M. 人類tRNA ^Lys的示意圖，tRNA ^Lys中的m5C48位點用紅色箭頭標記。
N. tRNA ^Lys中g(shù)RNA位置示意圖。
O. 使用dCasRx-Tet2 CD編輯器在HEK293T細胞中靶向m5C甲基化后，利用深度序列HiTOM分析tRNA ^Lys的m5C48位點m5C比率（n=3）。

（3）RCMS編輯器在人類細胞中的非靶向甲基化（Off-target methylation）

圖5：RCMS dCasRx-NSUN6編輯器的特異性和非靶向甲基化。

A. 通過RCMS dCasRx-NSUN6編輯器靶向RPSA的m5C甲基化后，m5C富集轉(zhuǎn)錄本的mRNA水平（n = 3）。
B. 通過RCMS dCasRx-NSUN2編輯器靶向KAT7的m5C去甲基化后，m5C富集轉(zhuǎn)錄本的mRNA水平（n = 3）。
C. 用RCMS dCasRx-Tet2 CD編輯器靶向BBS4的m5C去甲基化后，m5C富集轉(zhuǎn)錄本的mRNA水平（n = 3）。
D. 用dCasRx-NSUN6或dCasRx-NSUN6和RPSA靶向gRNA或非靶向gRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)的HEK293T細胞中m5C甲基化位點的差異富集。頂部代表上述條件下m5C位點的差異甲基化，表明差異甲基化位點具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。底部代表維恩圖，描繪了用于上述比較的所有甲基化m5C位點的重疊。用三個獨立的生物學(xué)重復(fù)進行BS-seq分析。非靶向gRNA用于非靶向。誤差線表示平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n.s.表示雙向方差分析和Dunnett多重比較不顯著。

（4）HepG2細胞中使用RCMS進行可編程RNA m5C修飾

圖6：RCMS dCasRx-NSUN6編輯器對HepG2細胞中的RPSA m5C位點進行修飾。

A. 深度序列HiTOM分析在RCMS dCasRx-NSUN6編輯器和RPSA gRNA-150 nt靶向下RPSA m5C234位點的m5C比率（n=3）。
B. dCasRx-NSUN6或dCasRx-dNSUN6聯(lián)合非靶向gRNA或RPSA gRNA-150 nt轉(zhuǎn)導(dǎo)的HEK293T細胞RPSA的mRNA水平（n = 3）。
C. 用dCasRx-NSUN6或dCasRx-dNSUN6聯(lián)合非靶向gRNA或RPSA gRNA-150 nt轉(zhuǎn)導(dǎo)的HEK293T細胞中RPSA的蛋白質(zhì)水平。
D. 通過RT-qPCR在指定的時間點檢測經(jīng)10 mg/ml放線菌素D處理的HEK293T細胞中RPSA水平（n=3）。
E. CCK8法檢測dCasRx-NSUN6或dCasRx-dNSUN6和非靶向gRNA或RPSA gRNA-150 nt轉(zhuǎn)導(dǎo)的HepG2細胞增殖（n=6） 。
F. 使用dCasRx-NSUN6和RPSA gRNA-150 nt對RPSA進行靶向甲基化的HepG2細胞的劃痕實驗的代表性圖像。在初始劃痕后0h和36h記錄劃痕測量值。比例尺：200微米。
G. 傷口愈合試驗的統(tǒng)計分析（n=3）。
 

圖7：RCMS dCasRx-NSUN6編輯器對HepG2細胞中的RPSA m5C位點進行修飾。

A. 利用深度序列HiTOM分析RCMS dCasRx-Tet2 CD編輯器和RPSA gRNA 0 nt靶向下RPSA m5C234位點的m5C比率（n=3） 。
B. dCasRx-Tet2 CD或dCas-dTet2 CD聯(lián)合非靶向gRNA或RPSA gRNA 0 nt轉(zhuǎn)導(dǎo)的HEK293T細胞RPSA的mRNA水平（n = 3）。
C. dCasRx-Tet2 CD或dCasRx-dTet2 CD聯(lián)合非靶向gRNA或RPSA gRNA 0 nt轉(zhuǎn)導(dǎo)的HepG2細胞RPSA的蛋白水平。
D. RT-qPCR在指定時間點檢測經(jīng)10 mg/ml放線菌素D處理的HepG2細胞中RPSA水平（n=3）。
E. CCK8法檢測轉(zhuǎn)染dCasRx-Tet2 CD或dCasRx-dTet2 CD和非靶向gRNA或RPSA gRNA 0 nt的HepG2細胞增殖（n=6）。
F. dCasRx-Tet2 CD和RPSA gRNA 0 nt對RPSA進行靶向甲基化的HepG2細胞中傷口愈合實驗的代表性圖像。在初始劃痕后0和36小時記錄劃痕測量。比例尺：200微米。
G. 傷口愈合實驗的統(tǒng)計分析。

研究小結(jié)
本研究標志著RCMS作為一種靶向表觀轉(zhuǎn)錄組編輯工具的開創(chuàng)性建立，并探討了其潛在應(yīng)用。研究揭示了RCMS的廣泛功能，允許在跨RNA靶標中進行精確的位點特異性m5C摻入或去除。這以甲基化依賴性方式改變了細胞轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性。研究新開發(fā)的RCMS具有特異性潛能可以闡明m5C與表型之間的功能關(guān)系，并推進m5C生物學(xué)的基礎(chǔ)研究。
 
參考文獻：
Zhang T, Zhao F, Li J, Sun X, Zhang X, Wang H, Fan P, Lai L, Li Z, Sui T. Programmable RNA 5-methylcytosine (m5C) modification of cellular RNAs by dCasRx conjugated methyltransferase and demethylase. Nucleic Acids Res. 2024 Feb 15. pii: 7608824. doi: 10.1093/nar/gkae110. PubMed PMID: 38366553.