鎘(Cd)污染因其毒性在全球范圍內(nèi)造成了嚴重的生態(tài)問題，重金屬對植物造成的傷害除了離子毒害效應，還會影響植物的水分狀況，造成植物生理干旱。當前，干旱也已成為全球農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)和發(fā)展的重大威脅。

胡楊（Populus euphratica）是廣泛分布于我國西北干旱、鹽堿地區(qū)的一種高大喬木，具有很強的抗旱耐鹽能力，并且能夠吸收和積累重金屬，是研究樹木抗逆生理和分子機制的重要模式樹種。

鈣(Ca²⁺)是植物感知生物和非生物脅迫的典型信號分子，Ca²⁺信號和cpk對廣泛的環(huán)境刺激做出反應，并協(xié)調(diào)信號網(wǎng)絡和生理反應(Poovaiah等，2013)。然而，Ca²⁺信號和cpk是否調(diào)節(jié)植物對重金屬的反應很少被研究。

2023年12月19日，北京林業(yè)大學陳少良教授課題組研究成果，發(fā)表在Plant Stress期刊上（影響因子5.0），文章題目為Populus euphratica CPK21 interacts with heavy metal stress-associated proteins to mediate Cd tolerance in Arabidopsis。

 

該研究借助HaloTag pull-down技術，富集了PeCPK21相互作用蛋白，Cd處理后相應的表達譜表明，PeCPK21與重金屬脅迫相關蛋白(HMAPs)相互作用，介導了轉(zhuǎn)基因擬南芥對Cd的耐受性。
 

 

PeCPK21的表達在根和葉中不同。葉片中，PeCPK21轉(zhuǎn)錄物在CdCl₂處理3小時后增加，6小時達到峰值，隨后迅速下降，12h后進一步增加。根系中，Cd處理12 h后PeCPK21顯著增加，24h達到峰值，而后迅速下降。
 

 

胡楊PeCPK21啟動子構(gòu)建PeCPK21pro轉(zhuǎn)到擬南芥中。無CdCl₂脅迫，根、子葉和下胚軸中GUS信號濃度較低。CdCl₂脅迫，根，子葉和下胚軸中的GUS活性增加。結(jié)果表明Cd激活PeCPK21，PeCPK21在胡楊根葉表達增加。
 

 

作者選擇8個PeCPK21轉(zhuǎn)基因擬南芥品系，確定其在鎘脅迫下的作用。RT-qPCR表明，在轉(zhuǎn)基因系中表達高，OE2中表達最高，OE8最低。之后選OE3、OE7和OE10轉(zhuǎn)基因幼苗進行鎘實驗。CdCl₂處理WT、VC和三個轉(zhuǎn)基因系確定鎘耐受性的表型差異，結(jié)果表明，在CdCl₂脅迫下，PeCPK21正調(diào)控轉(zhuǎn)基因擬南芥根長、鮮重和膜穩(wěn)定性。

 

Cd熒光探針檢測根部細胞Cd含量。用CdCl₂處理后，所有根細胞熒光顯著增加，轉(zhuǎn)基因擬南芥熒光強度相對較低，對照組幾乎無熒光，這表明PeCPK21抑制Cd在擬南芥根積累。NMT監(jiān)測擬南芥幼苗根尖中Cd通量，對照組中根頂端區(qū)域通量低，幼苗中Cd通量高，而轉(zhuǎn)基因系OE3、OE7和OE10的Cd²⁺通量顯著降低。

 
 

 

為探究PeCPK21介導Cd和ROS穩(wěn)態(tài)的功能，用HaloTag pull-down技術富集與PeCPK21相互作用蛋白。該實驗過程是使用體外真核蛋白表達系統(tǒng)將PeCPK21表達出來，再與胡楊的總蛋白進行Pull down實驗，最后將與PeCPK21結(jié)合的蛋白進行質(zhì)譜鑒定。

與PeCPK21相互作用的HaloTag pull-down富集蛋白列中，分為四組：

（I）陽離子/重金屬轉(zhuǎn)運蛋白、膜聯(lián)蛋白、K+–H+交換樣蛋白（KHEP）、鈣單向轉(zhuǎn)運蛋白、銅轉(zhuǎn)運蛋白5（COPT5）、寡肽轉(zhuǎn)運蛋白3（OPT3）、植物防御素樣蛋白2.2（PDF2.2）、PM相關陽離子結(jié)合蛋白（PCAP1）和ABC轉(zhuǎn)運蛋白I家族成員6（ABCI6）;

（II）質(zhì)子泵亞基、V型質(zhì)子ATP酶亞基a3（VHAa3）、VHA-B1、VHA-C、焦磷酸鹽活化膜質(zhì)子泵2（AVPL1）和V型質(zhì)子ATP酶蛋白脂質(zhì)亞基（AVA-P2）;

（III）抗氧化酶，類囊體抗壞血酸過氧化物酶（TAPX），超氧化物歧化酶（MSD1），抗壞血酸過氧化物酶1（APX1），APX2，APX3，硫氧還蛋白M4（TRXM4），9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED1），谷胱甘肽過氧化物酶（GPX3），硫氧還蛋白樣蛋白CDSP32和硫氧還蛋白超家族蛋白（PRXQ）;

（IV）膜內(nèi)源蛋白、質(zhì)膜內(nèi)源蛋白1;1（PIP1-1）、PIP2-6、PIP2-7、PIP2A和tonoplast內(nèi)源蛋白。
 

 

通過鈣滲透通道介導Cd進入的膜聯(lián)蛋白的轉(zhuǎn)錄被CdCl₂上調(diào)，在PeCPK21-OE3、7、10中低于WT和VC。CdCl₂增加擬南芥中鈣單向轉(zhuǎn)運體、KHEP、COPT5、OPT3和PDF2.2的表達，但在PeCPK21過表達系中觀察到更高的水平。然而，用CdCl₂處理所有樣品中PCAP1和ABCI6的轉(zhuǎn)錄并未顯著改變。
 

CdCl₂處理增加了所有測試品系中VHA-B1、VHA-C、AVPL1和AVA-P2的表達。與WT和VC相比，VHAB1、VHA-C和AVA-P2的Cd誘導在PeCPK21過表達的品系中更為明顯。然而，在所有測試品系中，VHA-a3的轉(zhuǎn)錄均未改變。

所有測試品系證明CdCl₂上調(diào)PeCPK21相互作用的幾種抗氧化酶的表達。與WT和VC相比，這些抗氧化酶TAPX、APX1、APX2、TRXM4、NCED1、GPX3、CDSP32、PRXQ在PeCPK21-OE3、7、10中表達量高。

CdCl₂脅迫后，PIP1-1、PIP2A和PIP2-7的轉(zhuǎn)錄水平增加，與WT和VC相比，PeCPK21過表達植物的水平更高。CdCl₂處理不影響PIP2-6和TIP1的轉(zhuǎn)錄。
 

綜上所述，Cd通過激活PeCPK21啟動子上調(diào)胡楊PeCPK21的轉(zhuǎn)錄。鈣傳感器PeCPK21可以提高植物對Cd脅迫的耐受能力，表現(xiàn)為過表達PeCPK21的擬南芥的根和全株生長減少較少。HaloTag pull-down富集蛋白和相應的表達譜表明，PeCPK21通過與多種重金屬脅迫相關蛋白相互作用，限制Cd積累，增加ROS清除，改善轉(zhuǎn)基因擬南芥的水分狀況，從而提高Cd耐受性。
 

體外蛋白表達與Pull down技術相結(jié)合，表達出目的蛋白和標簽蛋白（Halo，GST，His等）的融合蛋白，不受抗體和物種限制，僅借助標簽的親和介質(zhì)將目標蛋白純化出來，使用Pull down技術，將目標蛋白與互作的蛋白“下拉”，進而利用Western Blot或者質(zhì)譜鑒定互作蛋白。蛋白Pull down實驗還可以同時表達兩個蛋白，進行點對點的互作驗證，也可以僅表達蛋白質(zhì)的結(jié)合區(qū)域，確定兩個蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。
 
Halo/FLAG-tag pull down是使用基于真核的體外表達系統(tǒng)來表達目的蛋白，目的蛋白攜帶Halo/FLAG標簽；GST-tag pull down是使用基于原核的體外蛋白表達系統(tǒng)，或者大腸桿菌誘導表達目的蛋白，目的蛋白攜帶GST或His標簽。