作物產(chǎn)量取決于庫(kù)（sink，獲得同化物）的潛力和源（source，供給同化物）的能力，“源—庫(kù)”關(guān)系的優(yōu)化對(duì)作物產(chǎn)量調(diào)控具有重要意義。黃瓜（Cucumis sativus L.）是世界范圍內(nèi)廣泛種植的蔬菜，是我國(guó)具有巨大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的七大蔬菜之一，葉片和速生果實(shí)屬于黃瓜的“源”和“庫(kù)”器官。黃瓜是典型的棉子糖家族系列寡糖 (Raffinose family oligosaccharides, RFOs)轉(zhuǎn)運(yùn)植物，DNA甲基化是植物中常見(jiàn)的表觀遺傳修飾，但其在庫(kù)源調(diào)控中的作用尚未在RFO轉(zhuǎn)運(yùn)物種中得到證實(shí)。
 
2023年12月28日，揚(yáng)州大學(xué)園藝園林學(xué)院繆旻珉教授團(tuán)隊(duì)在《Plants》雜志以“The Sink-Source Relationship in Cucumber (Cucumis sativus L.) Is Modulated by DNA Methylation”為題發(fā)表研究論文，研究基于全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（whole-genome bisulfite sequencing）繪制了不同庫(kù)（sink）強(qiáng)度黃瓜葉片的表觀遺傳基因組圖譜，分析了DNA甲基化在黃瓜植物中如何影響“源—庫(kù)”關(guān)系，進(jìn)而可能影響植物產(chǎn)量。

標(biāo)題：The Sink-Source Relationship in Cucumber (Cucumis sativus L.) Is Modulated by DNA Methylation（黃瓜的源庫(kù)關(guān)系受DNA甲基化調(diào)控）
時(shí)間：2023-12-28
期刊：Plants
影響因子：IF 4.5
平臺(tái)：WGBS、RNA-seq等

研究摘要：
本研究通過(guò)全基因組（WGBS-seq）比較了兩種處理下的葉片：第12節(jié)點(diǎn)的非結(jié)果節(jié)葉（Nonfruiting-Node Leaves，NFNL）和坐果葉（leaves of fruit setting，F(xiàn)NL）。在這兩種處理中，其他節(jié)的雌性花均去除。研究結(jié)果揭示了大量差異甲基化基因在光合作用和碳水化合物代謝過(guò)程中富集。FNLs和NFNLs之間的比較轉(zhuǎn)錄組分析表明，許多具有差異甲基化區(qū)域的差異表達(dá)基因（DEGs）參與生長(zhǎng)素/乙烯和油菜素內(nèi)酯的代謝、蔗糖代謝、以及與庫(kù)源調(diào)控相關(guān)的RFO合成通路。此外，5-aza-dC-2'-脫氧胞苷（5-aza-dC，一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑）處理FNLs后，葉片中上述通路中6個(gè)庫(kù)源相關(guān)基因的DNA甲基化水平降低，RFO合成通路中的棉子糖合成酶（CsSTS）基因表達(dá)、酶活性和棉子糖含量上調(diào)，從而增加果實(shí)長(zhǎng)度和干重。本研究結(jié)果為DNA甲基化在庫(kù)源關(guān)系中的潛在作用提供了最新的推斷，這將為進(jìn)一步探索DNA甲基化在提高RFO轉(zhuǎn)運(yùn)植物產(chǎn)量中的分子機(jī)制提供重要參考。
 
研究結(jié)果
（1）非結(jié)果節(jié)葉（NFNLs）和坐果葉（FNLs）全基因組中重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）的動(dòng)態(tài)DNA甲基化圖譜
圖1：FNL和NFNL中全基因組DNA甲基化模式和差異甲基化區(qū)域（DMR）數(shù)量。

1. 黃瓜葉片F(xiàn)NLs和NFNLs表型。
2. CG、CHG和CHH平均DNA甲基化水平。
3. CG/CHG/CHH基因元件甲基化水平特征。
4. CG、CHG和CHH中差異甲基化區(qū)域（DMR）數(shù)量。
5. CG/CHG/CHH中CDS中下游2 kb、外顯子、基因體、基因間和上游2 kb的DMR數(shù)量。

（2）差異甲基化基因（DMGs）的GO分析

圖2：黃瓜FNLs和NFNLs之間差異甲基化基因（DMGs）的GO富集分析。

1. 在CG背景下差異甲基化基因（DMG）的GO富集。
2. 在CHH背景下DMG的GO富集。

（3）FNLs和NFNLs之間DNA甲基化與基因表達(dá)的相關(guān)性

圖3：與庫(kù)源調(diào)控相關(guān)的代謝通路中差異甲基化區(qū)域和差異表達(dá)基因的比較分析。

1. 生長(zhǎng)素；
2. 乙烯；
3. 油菜素內(nèi)酯（BR）的生物合成和代謝途徑。

AUX1：生長(zhǎng)素流入載體（AUX1-LAX家族）；IAA：生長(zhǎng)素反應(yīng)蛋白IAA；ARF：生長(zhǎng)素反應(yīng)因子；SAUR：SAUR家族蛋白；GH3：生長(zhǎng)素反應(yīng)性GH3基因家族；ERF1：乙烯反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子1；ETR：乙烯受體[EC:2.7.13.-]；EBF1/2：EIN3結(jié)合F-box蛋白；SIMKK：絲裂原活化蛋白激酶4/5[EC:2.7.12.2]；BRI1：蛋白質(zhì)油菜素類固醇不敏感1[EC:2.7.10.1 2.7.11.1]；BSK：BR信號(hào)激酶[EC:2.7.11.1]；BAK1：油菜素類固醇不敏感的1相關(guān)受體激酶1[EC:2.7.10.1，2.7.11.1]；BZR1/2：油菜素類固醇抗性1/2；CYCD3：細(xì)胞周期蛋白D3，植物；TCH4，木葡聚糖：木糖基轉(zhuǎn)移酶TCH4[EC:2.4.1.207]。
D.   蔗糖代謝通路。SUS：蔗糖合酶[EC:2.4.1.13]；INV：β-呋喃果糖苷酶[EC:3.2.1.26]；TPS：海藻糖6-磷酸合酶[EC:2.4.1.15；2.4.1.347]；TPP：海藻糖6-磷酸磷酸酶[EC:3.1.3.12]。
E.   RFO合成通路。GALE：UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶[EC:5.1.3.2]；SPS：蔗糖磷酸合酶[EC:2.4.1.14]；SPP：蔗糖磷酸酶[EC:3.1.3.24]；GolS：半乳糖醇合酶[EC:2.4.1.123]；RS：棉子糖合酶[EC:2.4.1.82]；STS：棉子糖合成酶[EC:2.4.1.67]。綠色框表示該基因被DMR修飾。熱圖顯示了RNA-seq中NFNL和FNL中差異表達(dá)基因（DEG）表達(dá)水平。Log2（FNL/NFNL）代表基因倍數(shù)變化，其中FNL/NFNL是指FPKM reads比率。


圖4：DNA甲基化富集與NFNLs和FNLs之間庫(kù)源調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)水平之間的相關(guān)性。

1. 左側(cè)和右側(cè)的縱坐標(biāo)分別表示CHH背景下的DNA甲基化水平和NFNL和FNL之間的相對(duì)表達(dá)水平。數(shù)據(jù)表示為RT-qPCR中的平均值±SD（n=3）。
2. DNA甲基化敏感的限制性核酸內(nèi)切酶消化，然后進(jìn)行PCR（Chop-PCR）驗(yàn)證NFNL和FNL之間的DNA甲基化水平。ClaI、AvaI、DpnI、SnaBI、FspEI和HpaII是甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶。未消化的DNA擴(kuò)增用作對(duì)照。

 
（4）5-Aza-dC對(duì)庫(kù)源關(guān)系的作用
圖5：5-aza-dC-2'-脫氧胞苷（5-aza-dC）處理后FNL中胞嘧啶-5 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（C5-MTase）和DNA去甲基化酶（dMTase）的表達(dá)譜。

1. FNLs上5-Aza-dC處理組和對(duì)照組的果實(shí)表型表征。
2. 擬南芥和C.sativus的dMTase基因之間關(guān)系的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。不同顏色的圓圈代表不同的物種。I和II代表兩個(gè)亞科。
3. 擬南芥和C.sativus的C5 MTase基因之間關(guān)系的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。I–III代表三個(gè)亞科。
4. 用和不用5-Aza-dC處理的FNL中甲基轉(zhuǎn)移酶基因和去甲基化酶基因的表達(dá)分析。

數(shù)據(jù)表示為RT-qPCR中的平均值±SD（n=3）。星號(hào)表示相對(duì)于CK組的顯著差異（*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，使用學(xué)生t檢驗(yàn)）。
 圖6：葉片庫(kù)源相關(guān)基因的表達(dá)譜和DNA甲基化水平以及FNLs上5-Aza-dC處理后的果實(shí)表型表征分析。

1. 通過(guò)Chop-PCR分析FNL和對(duì)照組的5-Aza-dC處理之間的DNA甲基化狀態(tài)。
2. CsGolS1、CsRS和CsSTS在FNLs中的相對(duì)表達(dá)水平。
3. FNL中cSGOL、cSR和cSST的酶活性。
4. FNLs的可溶性糖含量。
5. 果實(shí)長(zhǎng)度。
6. 果實(shí)干重。

數(shù)據(jù)表示為平均值，圖（B–D）中三個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和圖（E，F(xiàn)）中五個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。誤差線表示三/五個(gè)生物學(xué)重復(fù)之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差。星號(hào)表示相對(duì)于CK組的顯著差異（*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，使用學(xué)生t檢驗(yàn)）。
 
研究結(jié)論
源庫(kù)之間的光合產(chǎn)物分配是黃瓜產(chǎn)量的重要決定因素。本研究首次深入了解了黃瓜不同庫(kù)強(qiáng)度下的表觀遺傳譜。甲基化組和轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，DEGs參與生長(zhǎng)素/乙烯和油菜素內(nèi)酯的生物合成和代謝、蔗糖代謝，以及RFO合成通路受DNA甲基化調(diào)控。此外，經(jīng)5-Aza-dC處理的坐果葉（FNLs）促進(jìn)了果實(shí)生長(zhǎng)。5-Aza-dC上調(diào)了CSST的相對(duì)表達(dá)，CSST酶活性和參與葉片同化物負(fù)荷的棉子糖含量，表明5-Aza-dC在庫(kù)源調(diào)控中的重要作用。這項(xiàng)研究揭示了DNA甲基化對(duì)庫(kù)源關(guān)系的貢獻(xiàn)，并提出了通過(guò)改變DNA甲基化來(lái)提高黃瓜產(chǎn)量的可能性。

參考文獻(xiàn)：Wang Y, Zhang H, Gu J, Chen C, Liu J, Zhang Z, Hua B, Miao M. The Sink-Source Relationship in Cucumber (Cucumis sativus L.) Is Modulated by DNA Methylation. Plants (Basel). 2023 Dec 28;13(1) pii: plants13010103. doi: 10.3390/plants13010103. PubMed PMID: 38202411.