蛋白質(zhì)印跡或免疫印跡 (Western blot，簡稱 WB) 是一種常見的實驗室方法，用于檢測蛋白質(zhì)并評估其表達水平。根據(jù)其分子量和與特定抗體的免疫反應(yīng)性來鑒定感興趣的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)印跡由一系列相互關(guān)聯(lián)的步驟組成 (圖 1)[1]。

 

圖 1. 蛋白質(zhì)印跡相互關(guān)聯(lián)的步驟^[1]。 

 (1) 將樣品 (通常是蛋白質(zhì)混合物) 加載到凝膠上。Marker 標(biāo)記包含各種已知分子量的預(yù)標(biāo)記蛋白質(zhì)，與蛋白質(zhì)樣品一起加載到凝膠上作為尺寸參考。(2) 凝膠電泳用于根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量來分離蛋白質(zhì)。(3) 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移或“印跡”到膜上。(4) 封閉膜以減少非特異性結(jié)合，然后依次用特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白的一抗和二抗進行探測。后者結(jié)合一抗并攜帶允許隨后檢測的酶或熒光團。(5) 分別通過化學(xué)發(fā)光反應(yīng)或熒光檢測信號。(6) 準(zhǔn)備蛋白質(zhì)印跡圖像以供發(fā)表。

由于該實驗時間長、細節(jié)多，從樣品制備到顯影，每個步驟中都可能存在問題，最后得到的條帶往往千奇百怪、不盡人意……在這篇推文中，我們將為您介紹一些常見的 WB 實驗問題以及相應(yīng)的解決方案[2]。小 M 助您避免實驗中的各種困擾，快來看看吧！

 

▐ 1. 微笑條帶：

可能性原因：遷移過快、電泳緩沖液溫度偏高、蛋白質(zhì)超載或孔內(nèi)運行緩沖液不足。

建議：應(yīng)降低遷移速度、預(yù)冷緩沖液、減少蛋白上樣量、緩沖液完全覆蓋孔，確保內(nèi)室緩沖液不會泄露到外室[4][6]。

▐ 2. 皺眉條帶：

可能性原因：裝置不合適，可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。

建議：可通過調(diào)整裝置來避免該問題。

▐ 3. 條帶拖尾：

可能性原因：樣品溶解不好；存在一定程度地蛋白降解；電泳液反復(fù)多次使用。

建議：樣品充分溶解混勻后上樣；盡量使用新鮮樣本；使用新鮮配制的電泳緩沖液。

▐ 4. 啞鈴狀不均勻條帶：

可能性原因：配置膠有問題，膠凝固后不均一；樣品可能含有過多雜質(zhì)。

建議：重新配置膠，確保膠質(zhì)量無問題來避免該現(xiàn)象出現(xiàn)；在樣品使用前離心。

▐ 5. 條帶粘連：

可能性原因：可能是上樣量太多，或者是制膠問題，分離膠和濃縮膠之間有間隙，樣品竄孔。

建議：可通過減少上樣量和提高配膠質(zhì)量來避免。

▐ 6. 條帶空泡：

可能性原因：轉(zhuǎn)膜時膜上有氣泡

建議：確保在組裝“三明治”時，移除凝膠和印跡膜間的所有氣泡。

▐ 7. 背景有不均勻的黑色斑點：

可能性原因：封閉液未完全溶解，使不容顆粒附著在膜上從而導(dǎo)致發(fā)光時候膜上形成黑點；或抗體在膜上分布不均；

建議：封閉液一定要充分溶解，封閉結(jié)束之后要用 TBST 清洗三遍再加一抗；抗體孵育時保持搖動。

▐ 8. 條帶空斑：

可能性原因：目的蛋白條帶中間空白，周圍背景正常。該現(xiàn)象可能是一抗二抗?jié)舛冗^高，促使底物過快消耗，從而導(dǎo)致在進行化學(xué)發(fā)光時，底物耗盡形成空斑。

建議：可減少蛋白上樣量；降低一抗和二抗?jié)舛�；或者稀釋顯影液。

通過本篇推文介紹，相信普通的難題已經(jīng)難不倒你們了! 如果以上內(nèi)容沒有解決您的問題，歡迎大家在下方留言，小 M 歡迎大家積極交流實驗中遇到的各種疑難問題~

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Beta Actin Antibody HRP Conjugated 常用的內(nèi)參抗體之一，可檢測 Beta Actin 總蛋白的內(nèi)源水平。

alpha Tubulin Rabbit mAb 可檢測 alpha-tubulin 總蛋白的內(nèi)源水平，并不會與重組 β-tubulin 蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。

c-Myc Rabbit mAb 該抗體可檢測 c-Myc 總蛋白的內(nèi)源水平。

HRP-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG H&L 鼠二抗，山羊來源的抗小鼠 IgG 抗體，用于小鼠背景下 WB、ELISA、IHC 實驗。

HRP-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG H&L 兔二抗，山羊來源的抗兔 IgG 抗體，用于兔子背景下 WB、IHC-P、ELISA 實驗。

Ultra High Sensitivity ECL Kit  飛克級別抗原檢測，一抗稀釋比可達釋1:1000 至1:50000 倍。  Protease Inhibitor Cocktail, mini-Tablet  (EDTA-Free) 在樣品制備、保存中可增加蛋白穩(wěn)定性。

MCE的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報，我們不為任何個人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)。

參考文獻：
[1] Kroon C, et.al. Blind spots on western blots: Assessment of common problems in western blot figures and methods reporting with recommendations to improve them. PLoS Biol. 2022 Sep 12;20(9):e3001783. 
[2] Cui Y. Optimization of blocking conditions for fluorescent Western blot. Anal Biochem. 2020 Mar 15;593:113598. 
[3] Begum H, et al. Western blotting: a powerful staple in scientific and biomedical research. Biotechniques. 2022 Jun;73(1):58-69. 
[4] Mary Johnson. Materials and Methods ，Western Blot - Protocol, Troubleshooting, and Survey Results on Instruments and Reagents. 
[5] Gilda JE, et al. Western Blotting Inaccuracies with Unverified Antibodies: Need for a Western Blotting Minimal Reporting Standard (WBMRS). PLoS One. 2015 Aug 19;10(8):e0135392. 
[6] Sule R, et al. Western blotting (immunoblotting): history, theory, uses, protocol and problems. Biotechniques. 2023 Sep;75(3):99-114.