近日，南昌大學(xué)藥學(xué)院張春波團(tuán)隊(duì)和Monash University神經(jīng)科學(xué)系Patrick Kwan團(tuán)隊(duì)在Journal of Advanced Research（IF=10.7）上發(fā)表了題為“An integrated in vitro human iPSCs-derived neuron and in vivo animal approach for preclinical screening of anti-seizure compounds”的研究論文，建立了整合體外人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）誘導(dǎo)神經(jīng)元和體內(nèi)動(dòng)物模型進(jìn)行抗癲癇藥物開(kāi)發(fā)的新方法，該方法具有保留人類(lèi)基因遺傳背景和高通量篩選的優(yōu)勢(shì)，打破了傳統(tǒng)抗癲癇藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中的物種影響和成本禁錮，有望提高藥物的篩選效率和成功率，通過(guò)該方法，研究者從14種天然化合物中鑒定出多種具有抗癲癇效果的化合物。南昌大學(xué)藥學(xué)院張春波教授和Monash University神經(jīng)科學(xué)系Patrick Kwan教授為論文共同通訊作者，南昌大學(xué)藥學(xué)院博士研究生趙春芳和Monash University神經(jīng)科學(xué)系研究員Ben Rollo博士為論文共同第一作者。

研究者首先通過(guò)神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子Neurogenin2，NGN2）將iPSCs誘導(dǎo)為神經(jīng)元，并通過(guò)免疫熒光染色和多電極陣列（Multielectrode array，MEA）體外電生理檢測(cè)確認(rèn)神經(jīng)元特征，然后用促驚厥藥4-氨基吡啶（4-aminopyridine，4-AP）建立了iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)元癲癇模型（圖1）。

圖1 iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)元癲癇模型的構(gòu)建

研究者利用一線抗癲癇藥物卡馬西平（carbamazepine, CBZ）和苯妥英鈉（phenytoin sodium，PHT）和已報(bào)道過(guò)具有抗癲癇潛力的天然化合物α-細(xì)辛腦（α-asarone，ASA）和姜黃素（curcumin，CUR）在24孔MEA板驗(yàn)證了iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)元癲癇模型識(shí)別抗癲癇化合物的適用性 (圖2)。

圖2 卡馬西平、苯妥英鈉、α-細(xì)辛腦、姜黃素在iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)癲癇模型的抗癲癇效果驗(yàn)證

研究者在96孔MEA板測(cè)試了另外12種天然化合物，即長(zhǎng)春西�。╲inpocetine， VIN），厚樸酚（magnolol，MAG），川芎嗪（ligustrazine，LIG），蛇床子素（Osthole，OST)，丹參酮ⅱA（Tanshinone ⅱA，TAN），胡椒堿（Piperine， PIP），天麻素（gastrodin，GAS），槲皮素（quercetin，QUE），小檗堿（Berberine，BER），白楊素（chrysin，CHR），五味子甲素（Schizandrin A， SCH）和白藜蘆醇（resveratrol，RES）。五味子甲素、厚樸酚和長(zhǎng)春西汀在10µM和100µM時(shí)均可降低4-AP誘導(dǎo)的神經(jīng)元放電率，小檗堿、蛇床子素和胡椒堿在100µM時(shí)完全抑制4-AP誘導(dǎo)的神經(jīng)元放電(圖3)。

為了驗(yàn)證iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞模型的可靠性，研究者評(píng)估了化合物對(duì)PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)癲癇模型的作用。結(jié)果顯示，卡馬西平在50µg/mL和100µg/mL時(shí)呈劑量依賴性抑制PTZ誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作，α-細(xì)辛腦、胡椒堿和蛇床子素在10µg/mL、50µg/mL和100µg/mL時(shí)顯著降低PTZ誘導(dǎo)的癲癇活動(dòng)，厚樸酚在5µg/mL、10µg/mL和20µg/mL時(shí)顯著降低PTZ誘導(dǎo)的癲癇活動(dòng)，長(zhǎng)春西汀和小檗堿在100µg/mL和200µg/mL下也有抗癲癇作用（圖4）。

圖4 天然化合物在斑馬魚(yú)癲癇模型中的抗癲癇效果

為了進(jìn)一步比較體內(nèi)和體外模型的一致性，研究者在PTZ誘導(dǎo)小鼠癲癇模型中，測(cè)試了在iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)元中表現(xiàn)出抗癲癇作用的8種天然化合物的抗癲癇能力。200mg/kg 卡馬西平降低了小鼠的全面強(qiáng)直陣攣發(fā)作頻率；100mg/kg厚樸酚顯著降低了癲癇發(fā)作頻率，并延長(zhǎng)了首次癲癇發(fā)作的潛伏期；胡椒堿在100 mg/kg、200 mg/kg和300 mg/kg劑量下顯著抑制癲癇發(fā)作次數(shù)，并有明確的劑量依賴性反應(yīng)；α-細(xì)辛腦在120 mg/kg和150 mg/kg時(shí)具有顯著抑制作用；蛇床子素在300 mg/kg時(shí)具有顯著的抑制癲癇作用；300 mg/kg和1 g/kg劑量的姜黃素延長(zhǎng)了癲癇發(fā)作的潛伏期，但對(duì)癲癇發(fā)作次數(shù)無(wú)顯著影響，提示有輕度抑制作用(圖5)。研究者還在小鼠急性發(fā)作模型中評(píng)估了在iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)元和斑馬魚(yú)中篩選出的6種陰性化合物，即白楊素，天麻素，白藜蘆醇，槲皮素，川芎嗪和丹參酮ⅱa，結(jié)果顯示這些化合物均未降低癲癇發(fā)作頻率，也未延長(zhǎng)首次癲癇發(fā)作潛伏期。

最后，研究者比較分析了用于化合物篩選的iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)元、斑馬魚(yú)和小鼠模型的一致性。8種天然化合物（胡椒堿，厚樸酚，α-細(xì)辛腦，蛇床子素，姜黃素，長(zhǎng)春西汀，小檗堿，五味子甲素）抑制了iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)元的癲癇樣活動(dòng)，在這8種化合物中，有6種（胡椒堿、厚樸酚、α-細(xì)辛腦、蛇床子素、長(zhǎng)春西汀、小檗堿）在斑馬魚(yú)PTZ模型中表現(xiàn)出抗癲癇作用，5種（胡椒堿、厚樸酚、α-細(xì)辛腦、蛇床子素、姜黃素）在小鼠PTZ模型中表現(xiàn)出強(qiáng)的抗癲癇作用(圖6）。值得注意的是，在iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)元模型中無(wú)效的化合物在斑馬魚(yú)或小鼠模型中均未顯示出抗癲癇作用。

圖6 三種模型的比較

該研究開(kāi)發(fā)了一種新的整合體內(nèi)外模型的抗癲癇藥物篩選模式，兼具人類(lèi)基因遺傳背景和高通量特性，有望進(jìn)一步促進(jìn)抗癲癇藥物開(kāi)發(fā)。利用這種方法，研究者在體外鑒定出了8種具有抗癲癇作用的天然化合物。其中，胡椒堿，厚樸酚，α-細(xì)辛腦和蛇床子素在兩個(gè)體內(nèi)模型中也顯示出減少癲癇發(fā)作的能力，表明它們是進(jìn)一步藥物開(kāi)發(fā)的潛在候選者。重要的是，通過(guò)比較分析，在體外模型中無(wú)效的化合物在兩個(gè)體內(nèi)模型中均無(wú)抗癲癇作用，這表明iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)模型在識(shí)別無(wú)效化合物(這是高通量篩選方法的關(guān)鍵屬性)方面具有較高的陰性預(yù)測(cè)值，以減少用于進(jìn)一步體內(nèi)評(píng)估的化合物數(shù)量。此外，這種整合方法彌補(bǔ)了單一篩選模型特有的局限性，例如在iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)元中簡(jiǎn)化了的大腦環(huán)境和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，以及斑馬魚(yú)和小鼠模型中缺乏的人類(lèi)遺傳背景。該研究在未來(lái)需進(jìn)一步完善。首先，為了識(shí)別具有新機(jī)制和靶點(diǎn)的化合物，未來(lái)需要篩選更大的化合物庫(kù)；其次，誘導(dǎo)的NGN2神經(jīng)培養(yǎng)物和化學(xué)驚厥劑誘導(dǎo)的短暫癲癇樣放電代表了大腦的高度簡(jiǎn)化模型，從而限制了完全重現(xiàn)大腦環(huán)境和癲癇網(wǎng)絡(luò)的能力，其他更復(fù)雜的藥物篩選模型(如患者來(lái)源的類(lèi)器官、組織)可能有助于克服這些局限性；第三，研究中確定的有效化合物需要詳細(xì)的機(jī)制研究。

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