馬鈴薯是全球消費(fèi)量最大的非谷類糧食作物。大多數(shù)商業(yè)馬鈴薯品種是同源四倍體，具有高度雜合的基因組，嚴(yán)重阻礙了遺傳分析和改良。栽培馬鈴薯主要是無(wú)性繁殖，加上四倍體遺傳，傳統(tǒng)的馬鈴薯育種效率低下，與玉米和水稻等其他主要作物相比，這大大限制了馬鈴薯育種的進(jìn)展，導(dǎo)致馬鈴薯市場(chǎng)多沿用數(shù)百年前的品種，缺乏多樣性和疾病抵抗力。自從單倍體馬鈴薯的第一個(gè)參考基因組(DM1-3 516 R44;(以下簡(jiǎn)稱DM)于2011年發(fā)布后，越來(lái)越多的研究聚焦于各種野生和栽培二倍體馬鈴薯材料的基因組組裝，為馬鈴薯的基礎(chǔ)研究和育種提供了寶貴資源。然而解決馬鈴薯同源四倍體基因組中的四個(gè)單倍型仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所黃三文團(tuán)隊(duì)，在2022年7月于植物領(lǐng)域國(guó)際權(quán)威刊物Molecular Plant上發(fā)表了題為“Genome architecture and tetrasomic inheritance of autotetraploid potato”的文章，重點(diǎn)報(bào)道了馬鈴薯的基因組結(jié)構(gòu)和四倍體遺傳研究。該研究團(tuán)隊(duì)采用了從頭組裝策略，結(jié)合了PacBio高保真HiFi讀取初步組裝和遺傳圖譜輔助多倍體圖拼接，獲得了3.15Gb基因組組裝，N50長(zhǎng)度為18.78Mb，并在48條染色體上錨定了3.03Gb的序列。這一高質(zhì)量的參考基因組為詳細(xì)研究自多倍體基因組的組成鋪平了道路。

據(jù)估計(jì)，馬鈴薯栽培品種C88的基因組大小約為3GB，將其離體苗的基因組DNA提取后，采用Sage Science 公司的多通道回收Sage ELF選擇性回收14-17kb片段，利用PacBio Sequel II測(cè)序平臺(tái)測(cè)序共生成了96.20 Gb的HiFi reads, N50長(zhǎng)度為16.70 kb。對(duì)于Ultra-long Nanopore文庫(kù)，采用SageHLS HMW 超長(zhǎng)片段回收儀進(jìn)行分選，產(chǎn)生153 Gb的ONT讀段用于組裝，N50長(zhǎng)度為66.3 kb。

繼而對(duì)C88植株的花、根、莖、幼葉和匍匐莖等組織分離總RNA，由Blue Pippin全自動(dòng)DNA片段回收儀得到cDNA的大小，在PacBio Sequel II平臺(tái)上完成測(cè)序（測(cè)序數(shù)據(jù)附表1）。

附表1  C88測(cè)序數(shù)據(jù)：

 

利用先進(jìn)的測(cè)序技術(shù)和多倍體圖譜分析方法相組合，成功實(shí)現(xiàn)了馬鈴薯C88一個(gè)染色體級(jí)別、單倍型解析基因組組裝。通過(guò)對(duì)四個(gè)單倍型的比較分析，揭示了四倍體基因組中廣泛的序列和表達(dá)差異。研究還發(fā)現(xiàn)了馬鈴薯同源著絲粒的不同進(jìn)化軌跡，并檢測(cè)到了不均勻分布在1034個(gè)自交后代中的雙重還原事件，是四倍體自交遺傳的特征。通過(guò)區(qū)分母系和父系單倍型集合，作者模擬了馬鈴薯四倍體雜交育種優(yōu)勢(shì)的起源，發(fā)現(xiàn)了3110個(gè)具有有害突變的四等位基因座，這些突變?cè)陔s合狀態(tài)下被兩個(gè)親本掩蓋。此項(xiàng)研究為了解自多倍體基因組的結(jié)構(gòu)提供了新的見(jiàn)解，并為馬鈴薯的育種提供了指導(dǎo)。

得益于測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，已有一些四倍體馬鈴薯品種的染色體規(guī)模單倍型基因組組裝結(jié)果被釋放出來(lái)。越來(lái)越多可用的基因組為了解栽培馬鈴薯和其他自多倍體物種的生物學(xué)提供了重要的資源。

本文中討論的Otava基因組和C88基因組組裝，都用到了最新的HiFi測(cè)序技術(shù)。他們之間的差異在于組裝策略的不同。在Otava組裝中，相位化的reads被分成不同的組，并分別重新組裝。而在C88組裝中，相位信息輸入到組裝軟件hifiasm中，并應(yīng)用多倍體圖譜分組來(lái)指導(dǎo)整個(gè)基因組圖譜的組裝和生成新的contigs。C88基因組在連續(xù)性（以contig N50為指標(biāo)，18.78 Mb對(duì)比7.1 Mb）和完整性（以BUSCO分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，98.4%對(duì)比97.3%）方面優(yōu)于Otava組裝。這表明多倍體圖譜分組的策略在提高基因組連續(xù)性和完整性方面是有效的。因此，C88基因組和Otava基因組為自交多倍體基因組的單倍型解析組裝提供了有力的例證。

超長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)在馬鈴薯基因組研究中的應(yīng)用，主要通過(guò)獲得更長(zhǎng)的DNA序列片段來(lái)改善基因組組裝的質(zhì)量。這種技術(shù)可以提供更準(zhǔn)確的序列信息，從而解決馬鈴薯基因組的連續(xù)性和完整性問(wèn)題。通過(guò)超長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)，研究人員可以更好地解析馬鈴薯基因組中的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和重復(fù)序列，揭示其基因組的特點(diǎn)和演化過(guò)程。此外，超長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)還可以幫助研究人員分析馬鈴薯基因組中的遺傳變異和基因表達(dá)差異，進(jìn)一步理解馬鈴薯的遺傳特性和基因調(diào)控機(jī)制。
 

10+kb：Nanopore常規(guī)測(cè)序文庫(kù)
型號(hào)：Blue Pippin 
Blue Pippin 全自動(dòng)DNA片段回收儀程序中自帶的High Pass模式，即設(shè)定好回收的起點(diǎn)，系統(tǒng)可以自動(dòng)回收起點(diǎn)以上的所有片段，干凈徹底的去除小片段DNA，有效提高Nanopore測(cè)序效率和質(zhì)量。

10-25kb：PacBio HiFi測(cè)序文庫(kù)
型號(hào)：Blue Pippin、Pippin HT、Sage ELF
PacBio HiFi測(cè)序?qū)�DNA文庫(kù)的長(zhǎng)度均一性要求較高，最佳片段范圍為10-25kb。Sage Science產(chǎn)品中的Pippin HT高速高通量DNA片段回收儀、Blue Pippin全自動(dòng)DNA片段回收儀 、Sage ELF多通道片段回收儀皆滿足該測(cè)序要求，而且Sage ELF還可將一樣本中不同長(zhǎng)度的片段同時(shí)回收，最大限度利用樣本。

 

型號(hào)：HLS系列
Ultra-long DNA片段回收的一個(gè)重要應(yīng)用是在ONT三代測(cè)序，可以最大發(fā)揮ONT測(cè)序長(zhǎng)度長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)。Sage Science公司針對(duì)超大片段文庫(kù)的制備，推出了Sage HLS超大片段回收型號(hào)，最大可回收2Mb的DNA片段。下圖所示PromethION同Sage HLS聯(lián)用，N50最大可到143.3kb。

Sage HLS片段篩選后Nanopore測(cè)序，N50 高達(dá) 143.3 kb05
長(zhǎng)片段DNA樣本質(zhì)控
 

Sage Science是全球領(lǐng)先的研發(fā)制造Pippin系列全自動(dòng)核酸電泳片段回收儀的生產(chǎn)廠家，擁有美國(guó)技術(shù)專利，各個(gè)型號(hào)產(chǎn)品可以高效完成不同長(zhǎng)度范圍的DNA片段的精準(zhǔn)回收，廣泛用于二代測(cè)序、三代測(cè)序以及多種分子生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域。

環(huán)亞生物科技有限公司作為美國(guó)Sage Science公司在中國(guó)區(qū)的獨(dú)家代理商，自2011年以來(lái)將Sage Science的產(chǎn)品線引入國(guó)內(nèi)，一直為國(guó)內(nèi)用戶提供專業(yè)的全自動(dòng)核酸片段回收系統(tǒng)的安裝測(cè)試、應(yīng)用培訓(xùn)，技術(shù)支持與售后維護(hù)工作，贏得客戶的一致好評(píng)與信任。環(huán)亞生物科技有限公司將一如既往的支持越來(lái)越多的Sage Science用戶。

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