MeRIP-seq等從m6A RNA甲基化角度揭示NFATc1對(duì)破骨細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制
雙膦酸鹽類藥物是強(qiáng)效骨吸收抑制劑，是治療骨質(zhì)疏松癥、多發(fā)性骨髓瘤、骨轉(zhuǎn)移等疾病的首選藥物。這些藥物通過抑制甲羥戊酸通路和促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡來促進(jìn)骨吸收。雙膦酸鹽類藥物是治療骨質(zhì)疏松癥和腫瘤相關(guān)骨病的標(biāo)志性藥物。然而，在幾十年的臨床應(yīng)用中，雙膦酸鹽類藥物已經(jīng)引起了嚴(yán)重的副作用。
m6A甲基化在骨代謝疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，未來針對(duì)m6A甲基化的分子靶向治療將補(bǔ)充甚至替代傳統(tǒng)藥物治療。那RNA甲基化是否參與雙膦酸鹽抑制破骨細(xì)胞過程呢？
2023年11月13日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院Jiang Li、Wei Wang，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院Wen-jia Wei，和南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院Ping Zhang團(tuán)隊(duì)合作在《Cell Death & Disease volume》雜志發(fā)表題為“ Exosome-targeted delivery of METTL14 regulates NFATc1 m6A methylation levels to correct osteoclast-induced bone resorption”的研究論文，該研究本研究采用MeRIP-Seq、熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、meRIP等方法從RNA甲基化角度闡明NFATc1對(duì)破骨細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制。
標(biāo)題：Exosome-targeted delivery of METTL14 regulates NFATc1 m6A methylation levels to correct osteoclast-induced bone resorption（外泌體靶向遞送METTL14可調(diào)節(jié)NFATc1 m6A甲基化水平，以糾正破骨細(xì)胞誘導(dǎo)的骨吸收）
時(shí)間：2023-11-13
期刊：Cell Death Dis
影響因子：IF 9 / 1區(qū)
技術(shù)平臺(tái)：MeRIP-seq、RNA-seq、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等
研究摘要：
骨質(zhì)疏松癥對(duì)公眾健康有著深遠(yuǎn)的影響。一線用藥雙膦酸鹽常引起頜骨壞死，同時(shí)抑制破骨細(xì)胞。因此，開發(fā)有效的治療方法非常重要。本研究結(jié)果表明，以4249A為功能位點(diǎn)的唑來膦酸(zoledronic acid，ZOL)導(dǎo)致的NFATc1 m6A甲基化水平升高與破骨細(xì)胞骨吸收能力減少高度相關(guān)。METTL14上游通過甲基化功能位點(diǎn)NFATc1調(diào)控破骨細(xì)胞骨吸收。下游的YTHDF1和YTHDF2在METTL14上調(diào)m6A甲基化水平后對(duì)NFATc1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控表現(xiàn)出拮抗作用。本研究采用MeRIP- seq、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、MeRIP等方法從RNA甲基化角度闡明NFATc1對(duì)破骨細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制。此外，外泌體上EphA2過表達(dá)是靶向遞送METTL14到破骨細(xì)胞的有效生物學(xué)方法。本研究表明外泌體釋放的METTL14可以通過增加NFATc1的m6A甲基化水平來抑制破骨細(xì)胞，幫助絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者保留骨量，避免引發(fā)頜骨壞死，從而成為治療骨質(zhì)疏松的新型生物活性分子。
研究結(jié)果
（1）高通量測(cè)序和差異表達(dá)基因
經(jīng)RANKL誘導(dǎo)后，在有或沒有ZOL (5 μM)刺激下分別收集RAW264.7細(xì)胞樣本。提取兩組樣本的總RNA進(jìn)行RNA-seq和m6A-seq檢測(cè)。
A-B. 熱圖和火山圖顯示CON組和ZOL組差異表達(dá)的mRNA。
C. KEGG分析在和弦圖中可視化。
D. RNA序列數(shù)據(jù)的破骨細(xì)胞分化過程中的變化基因集富集分析(GSEA)圖。
E. 兩組mRNA轉(zhuǎn)錄組中m6A富集圖譜。
F. 兩組中主要的共有motif中鑒定出m6A-seq peaks。
G. 在m6A-seq中發(fā)現(xiàn)的CON組和ZOL組之間的m6A peaks和m6A修飾基因數(shù)量。
H. m6A peak分布圖，顯示兩組中m6A peak占總peaks的比例。
I. 維恩圖顯示兩組中654個(gè)差異表達(dá)和差異m6a甲基化的交集基因(左)。根據(jù)mRNA水平和m6A甲基化水平對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分類(右)。
J. 氣泡圖顯示通過基因交叉分析獲得的差異表達(dá)基因?qū)Ω信d趣的生物過程的富集(圖1I的紅圈)。
（2）ZOL對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的作用
I. 熱圖顯示ZOL刺激后m6A甲基化相關(guān)酶的差異表達(dá)。
J. m6A斑點(diǎn)印跡法顯示雙膦酸鹽治療或未治療的絕經(jīng)后婦女的整體m6A水平。
K. ZOL刺激后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞中METTL14的mRNA和蛋白表達(dá)水平。數(shù)據(jù)代表三個(gè)生物重復(fù)，用平均值±SD表示(*p < 0.05)。不同字母(a、b、c、d、e)組間差異顯著(p < 0.05)。
（3）ZOL或METTL14抑制破骨細(xì)胞分化，并增加破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的m6A甲基化水平
（4）NFATc1基因參與METT14抑制破骨細(xì)胞分化過程，只有NFATc1 - 9片段表現(xiàn)出高水平m6A甲基化
圖4：METTL14對(duì)NFATc1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用
ZOL刺激后，將NFATc1轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞并制備用于進(jìn)一步研究。
A. TRAP染色和F-actin帶染色檢測(cè)兩組破骨細(xì)胞分化情況；比例尺:200 μm。
B. 兩組TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量、覆蓋率、細(xì)胞核直方圖。
C. 兩組RAW264.7細(xì)胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對(duì)表達(dá)水平。將si-NFATc1轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，制備用于進(jìn)一步研究。
D. TRAP染色和F-actin帶染色檢測(cè)兩組破骨細(xì)胞分化情況。比例尺:200 μm。
E. 兩組TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量、覆蓋率、細(xì)胞核直方圖。
F. 兩組RAW264.7細(xì)胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對(duì)表達(dá)水平。
將NFATc1或METTL14按不同分組分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，制備用于進(jìn)一步研究。
G. TRAP染色和F-actin帶染色檢測(cè)兩組破骨細(xì)胞分化情況。比例尺:200 μm。
H. 兩組TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量、覆蓋率、細(xì)胞核直方圖。
I. 兩組RAW264.7細(xì)胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對(duì)表達(dá)水平。
J. 在ZOL或METTL14刺激下，根據(jù)線性回歸分析預(yù)測(cè)NFATc1 mRNA半衰期。
K. ZOL刺激RAW264.7細(xì)胞后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測(cè)YTHDF1和YTHDF2的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
將si-YTHDF2或METTL14按不同分組分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，制備用于進(jìn)一步研究。
L. TRAP染色和F-actin帶染色檢測(cè)4組破骨細(xì)胞分化情況。比例尺:200 μm。
M. 4組TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量、覆蓋率及細(xì)胞核直方圖。
N. 4組RAW264.7細(xì)胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對(duì)表達(dá)水平。
O-P. 采用RT-qPCR和western blotting檢測(cè)4組RAW264.7細(xì)胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
數(shù)據(jù)代表三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用平均值±SD表示(*p < 0.05)。不同字母(a、b、c、d、e)組間差異顯著 (p < 0.05)。
（5）YTHDF2通過METTL14上調(diào)NFATc1的甲基化水平，從而對(duì)NFATc1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)
圖5：YTHDF1和YTHDF2對(duì)NFATc1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。
將YTHDF2或METTL14按不同分組分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，并制備用于進(jìn)一步研究。
A. TRAP染色和F-actin帶染色檢測(cè)4組破骨細(xì)胞分化情況。比例尺:200 μm。
B. 4組TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量、覆蓋率及細(xì)胞核直方圖。
C. 4組RAW264.7細(xì)胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對(duì)表達(dá)水平。
D. 分別采用RT-qPCR和western blot分析4組RAW264.7細(xì)胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
ZOL刺激RAW264.7細(xì)胞后，根據(jù)不同分組分別轉(zhuǎn)染YTHDF2、si-YTHDF2或si-METTL14，并制備用于進(jìn)一步研究。
E. TRAP染色和F-actin帶染色檢測(cè)4組破骨細(xì)胞分化情況；比例尺:200 μm。
F. 4組TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量、覆蓋率及細(xì)胞核直方圖。
G. 4組RAW264.7細(xì)胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對(duì)表達(dá)水平。
H. 分別采用RT-qPCR和western blot分析4組RAW264.7細(xì)胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
將YTHDF1或METTL14按不同分組分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，并制備用于進(jìn)一步研究。
I. TRAP染色和F-actin帶染色檢測(cè)4組破骨細(xì)胞分化情況;比例尺:200 μm。
J. 4組TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量、覆蓋率及細(xì)胞核直方圖。
K. 4組RAW264.7細(xì)胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對(duì)表達(dá)水平。
L. 分別采用RT-qPCR和western blot分析4組RAW264.7細(xì)胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
數(shù)據(jù)代表三個(gè)生物重復(fù)，用平均值±SD表示。不同字母(a和b)表示多個(gè)組之間的顯著差異(p < 0.05)。
（6）YTHDF1和YTHDF2在上調(diào)METTL14甲基化水平后對(duì)NFATc1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控表現(xiàn)出拮抗作用
圖6：EphA2-EphrinA2對(duì)接受外泌體的破骨細(xì)胞的影響。
A-D．RIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同條件下NFATc1–9、10片段的富集率。
E. 外泌體的電子顯微圖像。比例尺:100 nm。
F. MC3T3-1細(xì)胞分泌的外泌體大小分布。
G. western blot檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞裂解物或外泌體中TFIIB、Lamin A/C、HSP70、TSG101和CD63的蛋白水平。
H. 將EphA2轉(zhuǎn)染至ME3T3-E1細(xì)胞后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測(cè)外泌體中EphA2的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
I. 外泌體的冷凍透射電子顯微鏡圖像。紅色箭頭表示納米金探針(1.4 nm)與EphA2受體結(jié)合。比例尺:100 nm。
J. MC3T3-E1細(xì)胞外泌體進(jìn)入RAW264.7細(xì)胞的免疫熒光圖像。用PKH26標(biāo)記外泌體，并在有或沒有EphA2情況下過表達(dá)。比例尺:50 nm。
K. 熒光顯微鏡和TRAP染色分析顯示注射到骨髓pkh26標(biāo)記的外泌體。紅框表示外泌體被破骨細(xì)胞吸收。比例尺:200 μm、50 μm。
L. 免疫共沉淀(co-IP)分析表明EphA2-EphrinA2和EphrinA2-EphA2的結(jié)合作用。
M. METTL14轉(zhuǎn)染ME3T3-E1細(xì)胞后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測(cè)外泌體中METTL14的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
N. 大鼠活體成像分析顯示，Cy5.5標(biāo)記的外泌體特異性定位于左上頜第一磨牙拔除后的窩內(nèi)。
O. 拔牙8周后，大鼠雙膦酸鹽相關(guān)性頜骨壞死(BRONJ)及兩種外泌體處理組(Exo+METTL14和Exo+EphA2 +METTL14)的代表性圖片。
P. 注射ZOL或外泌體8周后，采用micro-CT觀察各組大鼠骨組織形態(tài)學(xué)變化。
數(shù)據(jù)代表三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用平均值±SD表示(*p < 0.05)。
（7）外泌體中的METTL14對(duì)體內(nèi)骨丟失具有明顯的挽救作用
圖7：METTL14在體內(nèi)的作用
將EphA2或METTL14轉(zhuǎn)染至MC3T3-E1細(xì)胞中，并按照不同的組分別或同時(shí)從細(xì)胞上清液外泌體中收集。
A-B. 外泌體注射8周后，采用micro-CT和H&E染色檢測(cè)骨組織形態(tài)學(xué)參數(shù)。比例尺:500 nm。
C. BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp和BMD 五組的直方圖。
D. TRAP染色評(píng)估破骨細(xì)胞分化和骨吸收能力。比例尺:200 μm、100 μm。
E. 破骨細(xì)胞Oc直方圖。TRAP S/BS及積分光密度值在各組間差異顯著。
F-G. 采用Ctsk和MMP9免疫組織化學(xué)染色評(píng)估破骨細(xì)胞分化和骨吸收能力。比例尺:200 μm、100 μm。
H-I. 5組間Ctsk、MMP9積分光密度直方圖。
J-K. 基于MS/BS, MAR和BFR/BS的骨皮質(zhì)動(dòng)態(tài)組織形態(tài)學(xué)測(cè)量的代表性圖像。比例尺:100 μm。
L. 小鼠體內(nèi)成像分析顯示，Cy5.5標(biāo)記的外泌體特異性定位于脛骨骨髓。
數(shù)據(jù)代表6個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用平均值±SD表示。不同字母(a、b、c)組間差異顯著(p < 0.05)。
研究小結(jié)：
本研究發(fā)現(xiàn)NFATc1基因m6A甲基化水平與破骨細(xì)胞誘導(dǎo)的骨吸收之間存在強(qiáng)相關(guān)性。4249 A是NFATc1基因的m6A甲基化功能位點(diǎn)。在先前的研究也報(bào)告了類似的結(jié)論。m6A修飾導(dǎo)致mRNA和lncRNA的局部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而促進(jìn)了異質(zhì)核不均一核糖核蛋白C (hnRNP C)的結(jié)合。2577個(gè)m6A殘基特異性地破壞了lncRNA MALAT1的發(fā)夾柄（hairpin-stem）穩(wěn)定性，從而增加對(duì)向U-tract的可及性或單鏈性，并改善了與hnRNP C的互作。通過m6A依賴性RNA結(jié)構(gòu)重塑來調(diào)控RNA-蛋白質(zhì)互作機(jī)制被稱為“m6A開關(guān)（m6A switch）”。m6A功能位點(diǎn)是相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)的核心。這個(gè)位于NFATc1 4249 A的“m6A開關(guān)”與破骨細(xì)胞分化和骨吸收密切相關(guān)。METTL14、YTHDF1或YTHDF2在不同程度上調(diào)控“m6A開關(guān)”節(jié)點(diǎn)。兩個(gè)研究結(jié)果表明，與m6A甲基化相關(guān)的破骨細(xì)胞骨吸收由同一信號(hào)通路(NFκB)中不同的關(guān)鍵分子(上游RANK和下游NFATc1)共同調(diào)控。這一發(fā)現(xiàn)證明了m6A甲基化在破骨細(xì)胞分化過程中起著關(guān)鍵作用，并且每個(gè)關(guān)鍵分子的基因上都有m6A甲基化功能位點(diǎn)。這一理論基礎(chǔ)為通過m6A甲基化功能位點(diǎn)精確控制破骨細(xì)胞分化治療骨質(zhì)疏松癥提供了新的思路。
參考文獻(xiàn)：
Yang JG, Sun B, Wang Z, Li X, Gao JH, Qian JJ, Li J, Wei WJ, Zhang P, Wang W. Exosome-targeted delivery of METTL14 regulates NFATc1 m6A methylation levels to correct osteoclast-induced bone resorption. Cell Death Dis. 2023 Nov 13;14(11):738. pii: 10.1038/s41419-023-06263-4. doi: 10.1038/s41419-023-06263-4. PubMed PMID: 37957146.
m6A甲基化在骨代謝疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，未來針對(duì)m6A甲基化的分子靶向治療將補(bǔ)充甚至替代傳統(tǒng)藥物治療。那RNA甲基化是否參與雙膦酸鹽抑制破骨細(xì)胞過程呢？
2023年11月13日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院Jiang Li、Wei Wang，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院Wen-jia Wei，和南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院Ping Zhang團(tuán)隊(duì)合作在《Cell Death & Disease volume》雜志發(fā)表題為“ Exosome-targeted delivery of METTL14 regulates NFATc1 m6A methylation levels to correct osteoclast-induced bone resorption”的研究論文，該研究本研究采用MeRIP-Seq、熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、meRIP等方法從RNA甲基化角度闡明NFATc1對(duì)破骨細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制。
標(biāo)題：Exosome-targeted delivery of METTL14 regulates NFATc1 m6A methylation levels to correct osteoclast-induced bone resorption（外泌體靶向遞送METTL14可調(diào)節(jié)NFATc1 m6A甲基化水平，以糾正破骨細(xì)胞誘導(dǎo)的骨吸收）
時(shí)間：2023-11-13
期刊：Cell Death Dis
影響因子：IF 9 / 1區(qū)
技術(shù)平臺(tái)：MeRIP-seq、RNA-seq、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等
研究摘要：
骨質(zhì)疏松癥對(duì)公眾健康有著深遠(yuǎn)的影響。一線用藥雙膦酸鹽常引起頜骨壞死，同時(shí)抑制破骨細(xì)胞。因此，開發(fā)有效的治療方法非常重要。本研究結(jié)果表明，以4249A為功能位點(diǎn)的唑來膦酸(zoledronic acid，ZOL)導(dǎo)致的NFATc1 m6A甲基化水平升高與破骨細(xì)胞骨吸收能力減少高度相關(guān)。METTL14上游通過甲基化功能位點(diǎn)NFATc1調(diào)控破骨細(xì)胞骨吸收。下游的YTHDF1和YTHDF2在METTL14上調(diào)m6A甲基化水平后對(duì)NFATc1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控表現(xiàn)出拮抗作用。本研究采用MeRIP- seq、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、MeRIP等方法從RNA甲基化角度闡明NFATc1對(duì)破骨細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制。此外，外泌體上EphA2過表達(dá)是靶向遞送METTL14到破骨細(xì)胞的有效生物學(xué)方法。本研究表明外泌體釋放的METTL14可以通過增加NFATc1的m6A甲基化水平來抑制破骨細(xì)胞，幫助絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者保留骨量，避免引發(fā)頜骨壞死，從而成為治療骨質(zhì)疏松的新型生物活性分子。
本研究示意圖
ZOL導(dǎo)致NFATc1 m6A甲基化水平增加，其中4249bp A為功能位點(diǎn)，與破骨細(xì)胞骨吸收功能下降高度相關(guān)。上游，METTL14通過甲基化功能位點(diǎn)NFATc1調(diào)控破骨細(xì)胞骨吸收。下游，YTHDF1和YTHDF2在METTL14上調(diào)m6A甲基化水平后對(duì)NFATc1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控表現(xiàn)出拮抗作用。研究結(jié)果
（1）高通量測(cè)序和差異表達(dá)基因
經(jīng)RANKL誘導(dǎo)后，在有或沒有ZOL (5 μM)刺激下分別收集RAW264.7細(xì)胞樣本。提取兩組樣本的總RNA進(jìn)行RNA-seq和m6A-seq檢測(cè)。
圖1：高通量測(cè)序和差異表達(dá)基因
經(jīng)RANKL誘導(dǎo)后，在有或沒有ZOL (5 μM)刺激下分別收集RAW264.7細(xì)胞樣本。提取兩組樣本的總RNA進(jìn)行RNA-seq和m6A-seq檢測(cè)。A-B. 熱圖和火山圖顯示CON組和ZOL組差異表達(dá)的mRNA。
C. KEGG分析在和弦圖中可視化。
D. RNA序列數(shù)據(jù)的破骨細(xì)胞分化過程中的變化基因集富集分析(GSEA)圖。
E. 兩組mRNA轉(zhuǎn)錄組中m6A富集圖譜。
F. 兩組中主要的共有motif中鑒定出m6A-seq peaks。
G. 在m6A-seq中發(fā)現(xiàn)的CON組和ZOL組之間的m6A peaks和m6A修飾基因數(shù)量。
H. m6A peak分布圖，顯示兩組中m6A peak占總peaks的比例。
I. 維恩圖顯示兩組中654個(gè)差異表達(dá)和差異m6a甲基化的交集基因(左)。根據(jù)mRNA水平和m6A甲基化水平對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分類(右)。
J. 氣泡圖顯示通過基因交叉分析獲得的差異表達(dá)基因?qū)Ω信d趣的生物過程的富集(圖1I的紅圈)。
（2）ZOL對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的作用
圖2：ZOL對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的作用
- 不同濃度的ZOL，成骨誘導(dǎo)21d或7d后對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞和BMSCs進(jìn)行茜素紅S（Alizarin Red S,ARS）或ALP（Alkaline phosphatase）染色。
- 不同濃度ZOL作用下MC3T3-E1細(xì)胞和BMSCs中ALP、Bglap、Col1α1和Runx2的相對(duì)表達(dá)水平。
- TRAP染色和F-actin帶染色檢測(cè)不同濃度ZOL作用下破骨細(xì)胞分化和骨吸收能力。比例尺:200 μm。
- 不同濃度ZOL作用下TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量、覆蓋率及細(xì)胞核的直方圖。
- 不同濃度ZOL作用下RAW264.7細(xì)胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對(duì)表達(dá)水平。
- western blot檢測(cè)不同濃度ZOL作用下RAW264.7細(xì)胞中c-fos、NFATc1、RANK和NFκB p-P65蛋白的表達(dá)水平。
I. 熱圖顯示ZOL刺激后m6A甲基化相關(guān)酶的差異表達(dá)。
J. m6A斑點(diǎn)印跡法顯示雙膦酸鹽治療或未治療的絕經(jīng)后婦女的整體m6A水平。
K. ZOL刺激后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞中METTL14的mRNA和蛋白表達(dá)水平。數(shù)據(jù)代表三個(gè)生物重復(fù)，用平均值±SD表示(*p < 0.05)。不同字母(a、b、c、d、e)組間差異顯著(p < 0.05)。
（3）ZOL或METTL14抑制破骨細(xì)胞分化，并增加破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的m6A甲基化水平
圖3：NFATc1–9片段對(duì)METT14調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化過程的作用。
首先，將METTL14轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞并制備用于進(jìn)一步研究。
- TRAP染色和F-actin帶染色檢測(cè)兩組破骨細(xì)胞分化情況。比例尺:200 μm。
- 兩組TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量、覆蓋率、細(xì)胞核直方圖。
- 兩組RAW264.7細(xì)胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對(duì)表達(dá)水平。
- TRAP染色和F-actin帶染色檢測(cè)兩組破骨細(xì)胞分化情況。比例尺:200 μm。
- 兩組trap陽性破骨細(xì)胞數(shù)量、覆蓋率、細(xì)胞核直方圖。
- 兩組RAW264.7細(xì)胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對(duì)表達(dá)水平。
- ZOL刺激后破骨細(xì)胞分化差異表達(dá)基因的熱圖。
- KEGG分析揭示了三個(gè)交集的差異表達(dá)基因：破骨細(xì)胞分化基因，MeRIP高表達(dá)基因和mRNA下調(diào)基因。
- RT-qPCR分析顯示ZOL刺激或METTL14過表達(dá)后10個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)水平。
- NFATc1的基因組位點(diǎn)示意圖。
- 在ZOL刺激或未刺激下，NFATc1轉(zhuǎn)錄本中meRIP-Seq的m6A peaks可視化。m6A peaks位于NFATc1的3‘UTR區(qū)。
- SRAMP網(wǎng)站上NFATc1潛在的m6A甲基化位點(diǎn)。
- 根據(jù)潛在的m6A甲基化位點(diǎn)將NFATc1分為9個(gè)片段。
- m6A-RT-qPCR檢測(cè)ZOL刺激后抗m6A組和抗IgG組之間NFATc1的9個(gè)片段富集情況。
- m6A-RT-qPCR檢測(cè)NFATc1–9、10片段隨著ZOL濃度的增加而富集。
- m6A-RT-qPCR檢測(cè)ZOL或si-METTL14刺激下NFATc1–9、10片段的富集情況。
（4）NFATc1基因參與METT14抑制破骨細(xì)胞分化過程，只有NFATc1 - 9片段表現(xiàn)出高水平m6A甲基化
圖4：METTL14對(duì)NFATc1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用ZOL刺激后，將NFATc1轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞并制備用于進(jìn)一步研究。
A. TRAP染色和F-actin帶染色檢測(cè)兩組破骨細(xì)胞分化情況；比例尺:200 μm。
B. 兩組TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量、覆蓋率、細(xì)胞核直方圖。
C. 兩組RAW264.7細(xì)胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對(duì)表達(dá)水平。將si-NFATc1轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，制備用于進(jìn)一步研究。
D. TRAP染色和F-actin帶染色檢測(cè)兩組破骨細(xì)胞分化情況。比例尺:200 μm。
E. 兩組TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量、覆蓋率、細(xì)胞核直方圖。
F. 兩組RAW264.7細(xì)胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對(duì)表達(dá)水平。
將NFATc1或METTL14按不同分組分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，制備用于進(jìn)一步研究。
G. TRAP染色和F-actin帶染色檢測(cè)兩組破骨細(xì)胞分化情況。比例尺:200 μm。
H. 兩組TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量、覆蓋率、細(xì)胞核直方圖。
I. 兩組RAW264.7細(xì)胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對(duì)表達(dá)水平。
J. 在ZOL或METTL14刺激下，根據(jù)線性回歸分析預(yù)測(cè)NFATc1 mRNA半衰期。
K. ZOL刺激RAW264.7細(xì)胞后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測(cè)YTHDF1和YTHDF2的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
將si-YTHDF2或METTL14按不同分組分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，制備用于進(jìn)一步研究。
L. TRAP染色和F-actin帶染色檢測(cè)4組破骨細(xì)胞分化情況。比例尺:200 μm。
M. 4組TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量、覆蓋率及細(xì)胞核直方圖。
N. 4組RAW264.7細(xì)胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對(duì)表達(dá)水平。
O-P. 采用RT-qPCR和western blotting檢測(cè)4組RAW264.7細(xì)胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
數(shù)據(jù)代表三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用平均值±SD表示(*p < 0.05)。不同字母(a、b、c、d、e)組間差異顯著 (p < 0.05)。
（5）YTHDF2通過METTL14上調(diào)NFATc1的甲基化水平，從而對(duì)NFATc1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)
圖5：YTHDF1和YTHDF2對(duì)NFATc1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。將YTHDF2或METTL14按不同分組分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，并制備用于進(jìn)一步研究。
A. TRAP染色和F-actin帶染色檢測(cè)4組破骨細(xì)胞分化情況。比例尺:200 μm。
B. 4組TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量、覆蓋率及細(xì)胞核直方圖。
C. 4組RAW264.7細(xì)胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對(duì)表達(dá)水平。
D. 分別采用RT-qPCR和western blot分析4組RAW264.7細(xì)胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
ZOL刺激RAW264.7細(xì)胞后，根據(jù)不同分組分別轉(zhuǎn)染YTHDF2、si-YTHDF2或si-METTL14，并制備用于進(jìn)一步研究。
E. TRAP染色和F-actin帶染色檢測(cè)4組破骨細(xì)胞分化情況；比例尺:200 μm。
F. 4組TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量、覆蓋率及細(xì)胞核直方圖。
G. 4組RAW264.7細(xì)胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對(duì)表達(dá)水平。
H. 分別采用RT-qPCR和western blot分析4組RAW264.7細(xì)胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
將YTHDF1或METTL14按不同分組分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，并制備用于進(jìn)一步研究。
I. TRAP染色和F-actin帶染色檢測(cè)4組破骨細(xì)胞分化情況;比例尺:200 μm。
J. 4組TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量、覆蓋率及細(xì)胞核直方圖。
K. 4組RAW264.7細(xì)胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對(duì)表達(dá)水平。
L. 分別采用RT-qPCR和western blot分析4組RAW264.7細(xì)胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
數(shù)據(jù)代表三個(gè)生物重復(fù)，用平均值±SD表示。不同字母(a和b)表示多個(gè)組之間的顯著差異(p < 0.05)。
（6）YTHDF1和YTHDF2在上調(diào)METTL14甲基化水平后對(duì)NFATc1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控表現(xiàn)出拮抗作用
圖6：EphA2-EphrinA2對(duì)接受外泌體的破骨細(xì)胞的影響。A-D．RIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同條件下NFATc1–9、10片段的富集率。
E. 外泌體的電子顯微圖像。比例尺:100 nm。
F. MC3T3-1細(xì)胞分泌的外泌體大小分布。
G. western blot檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞裂解物或外泌體中TFIIB、Lamin A/C、HSP70、TSG101和CD63的蛋白水平。
H. 將EphA2轉(zhuǎn)染至ME3T3-E1細(xì)胞后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測(cè)外泌體中EphA2的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
I. 外泌體的冷凍透射電子顯微鏡圖像。紅色箭頭表示納米金探針(1.4 nm)與EphA2受體結(jié)合。比例尺:100 nm。
J. MC3T3-E1細(xì)胞外泌體進(jìn)入RAW264.7細(xì)胞的免疫熒光圖像。用PKH26標(biāo)記外泌體，并在有或沒有EphA2情況下過表達(dá)。比例尺:50 nm。
K. 熒光顯微鏡和TRAP染色分析顯示注射到骨髓pkh26標(biāo)記的外泌體。紅框表示外泌體被破骨細(xì)胞吸收。比例尺:200 μm、50 μm。
L. 免疫共沉淀(co-IP)分析表明EphA2-EphrinA2和EphrinA2-EphA2的結(jié)合作用。
M. METTL14轉(zhuǎn)染ME3T3-E1細(xì)胞后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測(cè)外泌體中METTL14的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
N. 大鼠活體成像分析顯示，Cy5.5標(biāo)記的外泌體特異性定位于左上頜第一磨牙拔除后的窩內(nèi)。
O. 拔牙8周后，大鼠雙膦酸鹽相關(guān)性頜骨壞死(BRONJ)及兩種外泌體處理組(Exo+METTL14和Exo+EphA2 +METTL14)的代表性圖片。
P. 注射ZOL或外泌體8周后，采用micro-CT觀察各組大鼠骨組織形態(tài)學(xué)變化。
數(shù)據(jù)代表三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用平均值±SD表示(*p < 0.05)。
（7）外泌體中的METTL14對(duì)體內(nèi)骨丟失具有明顯的挽救作用
圖7：METTL14在體內(nèi)的作用將EphA2或METTL14轉(zhuǎn)染至MC3T3-E1細(xì)胞中，并按照不同的組分別或同時(shí)從細(xì)胞上清液外泌體中收集。
A-B. 外泌體注射8周后，采用micro-CT和H&E染色檢測(cè)骨組織形態(tài)學(xué)參數(shù)。比例尺:500 nm。
C. BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp和BMD 五組的直方圖。
D. TRAP染色評(píng)估破骨細(xì)胞分化和骨吸收能力。比例尺:200 μm、100 μm。
E. 破骨細(xì)胞Oc直方圖。TRAP S/BS及積分光密度值在各組間差異顯著。
F-G. 采用Ctsk和MMP9免疫組織化學(xué)染色評(píng)估破骨細(xì)胞分化和骨吸收能力。比例尺:200 μm、100 μm。
H-I. 5組間Ctsk、MMP9積分光密度直方圖。
J-K. 基于MS/BS, MAR和BFR/BS的骨皮質(zhì)動(dòng)態(tài)組織形態(tài)學(xué)測(cè)量的代表性圖像。比例尺:100 μm。
L. 小鼠體內(nèi)成像分析顯示，Cy5.5標(biāo)記的外泌體特異性定位于脛骨骨髓。
數(shù)據(jù)代表6個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用平均值±SD表示。不同字母(a、b、c)組間差異顯著(p < 0.05)。
研究小結(jié)：
本研究發(fā)現(xiàn)NFATc1基因m6A甲基化水平與破骨細(xì)胞誘導(dǎo)的骨吸收之間存在強(qiáng)相關(guān)性。4249 A是NFATc1基因的m6A甲基化功能位點(diǎn)。在先前的研究也報(bào)告了類似的結(jié)論。m6A修飾導(dǎo)致mRNA和lncRNA的局部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而促進(jìn)了異質(zhì)核不均一核糖核蛋白C (hnRNP C)的結(jié)合。2577個(gè)m6A殘基特異性地破壞了lncRNA MALAT1的發(fā)夾柄（hairpin-stem）穩(wěn)定性，從而增加對(duì)向U-tract的可及性或單鏈性，并改善了與hnRNP C的互作。通過m6A依賴性RNA結(jié)構(gòu)重塑來調(diào)控RNA-蛋白質(zhì)互作機(jī)制被稱為“m6A開關(guān)（m6A switch）”。m6A功能位點(diǎn)是相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)的核心。這個(gè)位于NFATc1 4249 A的“m6A開關(guān)”與破骨細(xì)胞分化和骨吸收密切相關(guān)。METTL14、YTHDF1或YTHDF2在不同程度上調(diào)控“m6A開關(guān)”節(jié)點(diǎn)。兩個(gè)研究結(jié)果表明，與m6A甲基化相關(guān)的破骨細(xì)胞骨吸收由同一信號(hào)通路(NFκB)中不同的關(guān)鍵分子(上游RANK和下游NFATc1)共同調(diào)控。這一發(fā)現(xiàn)證明了m6A甲基化在破骨細(xì)胞分化過程中起著關(guān)鍵作用，并且每個(gè)關(guān)鍵分子的基因上都有m6A甲基化功能位點(diǎn)。這一理論基礎(chǔ)為通過m6A甲基化功能位點(diǎn)精確控制破骨細(xì)胞分化治療骨質(zhì)疏松癥提供了新的思路。
參考文獻(xiàn)：
Yang JG, Sun B, Wang Z, Li X, Gao JH, Qian JJ, Li J, Wei WJ, Zhang P, Wang W. Exosome-targeted delivery of METTL14 regulates NFATc1 m6A methylation levels to correct osteoclast-induced bone resorption. Cell Death Dis. 2023 Nov 13;14(11):738. pii: 10.1038/s41419-023-06263-4. doi: 10.1038/s41419-023-06263-4. PubMed PMID: 37957146.
標(biāo)簽：
RNA甲基化
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