mRNA 疫苗是在體外轉(zhuǎn)錄好的一段編碼抗原蛋白的完整 mRNA，包含 5 部分：① 5’ 帽子結(jié)構(gòu)，② 5’ 非編碼區(qū) (untranslated region, UTR)，③ 一個編碼抗原的開放閱讀框(open reading frame, ORF)， ④ 3’ 非編碼區(qū)，⑤ 3’ poly (A) 尾 (圖 1)[1]。

 
 
 Tips：
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(1) 5’ 帽子結(jié)構(gòu)包含一個 7-甲基鳥苷 (m7G)，通過三磷酸橋連接到 mRNA 的5’端。5’ 端第y個或第二個核苷酸在核糖的 2’ 羥基上被甲基化 (2’ - O- methylation)，這阻止了 RNA 被細(xì)胞識別，從而阻止了非預(yù)期的免疫反應(yīng)。此外，5’ 帽子結(jié)構(gòu)在空間上保護(hù) mRNA 不被外切酶降解。

(2) 在 3’ 端，poly(A) 尾的長度間接調(diào)控 mRNA 的翻譯和半衰期。一個足夠長的尾巴 (100-150 bp) 是與 poly (A) 結(jié)合蛋白相互作用所必需的。poly (A) 結(jié)合蛋白和翻譯起始因子形成復(fù)合物招募核糖體啟動翻譯，并且保護(hù)帽子結(jié)構(gòu)免受降解酶。

(3) 編碼區(qū)側(cè)翼的 5’ UTR 和 3’ UTR 調(diào)控 mRNA 翻譯、半衰期和亞細(xì)胞定位。開放閱讀框包含翻譯成蛋白質(zhì)的編碼序列，可以通過將很少使用的密碼子替換為編碼相同氨基酸殘基的更頻繁出現(xiàn)的密碼子來優(yōu)化，從而在不改變蛋白質(zhì)序列的情況下增加翻譯量。例如， CureVac AG 公司在新冠疫苗 CVnCoV 用 G 或 C 代替 A 或 U（人類 mRNA 密碼子很少在第三位有 A 或 U）。

圖 1. 將無細(xì)胞生產(chǎn)的體外轉(zhuǎn)錄 mRNA 制成脂質(zhì)納米顆粒疫苗^[1]。 

A．體外轉(zhuǎn)錄 mRNA 的結(jié)構(gòu)示意圖。B. 制備 mRNA 疫苗的過程。(1) 病原體基因組測序完成后，設(shè)計目標(biāo)抗原的序列并插入到質(zhì)粒中。(2) 在體外通過噬菌體聚合酶將質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄為 mRNA。(3) 通過液相色譜 (HPLC) 純化 mRNA以去除污染物和反應(yīng)物。(4) 將純化好的 mRNA 與脂質(zhì)在微流控混合器中速混合，形成脂質(zhì)納米顆粒。(5) 將納米顆粒溶液透析或過濾以除去非水溶劑和任何未封裝的 mRNA。(6) 將過濾后的 mRNA 疫苗溶液保存在滅菌的瓶中。

 

mRNA 疫苗不需要復(fù)雜的細(xì)胞培養(yǎng)體系和表達(dá)純化體系，可在實(shí)驗(yàn)室直接合成，因而可以實(shí)現(xiàn)快速大規(guī)模生產(chǎn)。這些優(yōu)勢使得 mRNA 疫苗在 COVID-19 疫情防控中發(fā)揮著重要作用。

但 mRNA 不穩(wěn)定且難以遞送，而且，體外產(chǎn)生的 mRNA 會引起炎癥反應(yīng)。然而，在兩個關(guān)鍵技術(shù)上的突破使得 mRNA 疫苗技術(shù)高歌猛進(jìn)。

▐  脂質(zhì)納米遞送系統(tǒng)
裸的 mRNA 在體液中容易被核酸酶迅速降解，難以在靶組織中積累。此外，免疫系統(tǒng)也能夠識別并降解外源性的核酸引發(fā)免疫反應(yīng)[2]。所以 mRNA 的安全遞送對于 mRNA 疫苗的推廣使用十分重要。脂質(zhì)納米顆粒可保護(hù)核酸不被降解，向靶細(xì)胞遞送，并減少核酸對脫靶細(xì)胞的暴露。(詳見往期推文：“藥物如何遞送 ？脂質(zhì)納米顆粒！”)。

基于脂質(zhì)的納米顆粒是臨床上的 mRNA 遞送載體。截至 2021 年 6 月，所有正在開發(fā)或批準(zhǔn)用于臨床的 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗均采用脂質(zhì)納米顆粒(LNP)。

圖 2. 脂質(zhì)納米顆粒及組成^[1]。 

除了 RNA 藥物之外，LNP 通常還包括四種成分：可電離脂質(zhì) (如 DLin-MC3-DMA)、膽固醇 (如 DSPC)、輔助磷脂和聚乙二醇化脂質(zhì) (如 ALC-0159)，它們一起封裝并保護(hù)脆弱的 mRNA 核心。
▐  核苷修飾

Katalin Karikó 和 Drew Weissman 發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞和 TLR 表達(dá)的細(xì)胞可被細(xì)菌和線粒體 RNA 有效激活，但不能被哺乳動物總 RNA（其中含有豐富的修飾核苷）激活[3]。因此，他們假設(shè)核苷修飾抑制了 RNA 的免疫作用。通過使用含有修飾核苷的 RNA 刺激樹突狀細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)修飾的核苷確實(shí)可以阻止 TLR 受體的識別，特別是修飾的尿苷，誘導(dǎo)的 TNF-α 的表達(dá)量顯著降低[3]。

Moderna 和輝瑞-公司的新冠疫苗基于這一結(jié)論開發(fā)出含有修飾核苷的 mRNA 疫苗。并且這兩款新冠疫苗都在 III 期臨床試驗(yàn)中產(chǎn)生了 >94% 的療效。

圖 3. Katalin Karikó 和 Drew Weissman 對 RNA 核苷修飾的研究^[3][4]。

左圖: RNA 轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)TNF-α^[3]: a. 化學(xué)合成 (ORN1-4) 或體外轉(zhuǎn)錄 (ORN5-6) 的寡核苷酸序列轉(zhuǎn)染人樹突狀細(xì)胞; b-c. ELISA 或 Northern blot 檢測 TNF-α 表達(dá)量。
右圖: Ψ 修飾的 mRNA 具有更高的翻譯能力^[4]: a. 體外轉(zhuǎn)錄的含有或不含Ψ修飾的 capTEVlucA50 用 poly (A) 聚合酶延長了 3 '端 poly (A) 尾 (+An), 用于動物研究的 mRNA 用星號表示; b-d. 尾靜脈注射含有或不含 Ψ 修飾的 mRNA (capTEVluc-An) 脂質(zhì)體。處死動物后, (b-c) 對各組織進(jìn)行熒光素酶活性測定; (d) 并用 Northern blot 檢測 luciferase 和 TNF-α; e-f. 尾靜脈注射含有或不含 Ψ 修飾的 mRNA (capTEVluc-An) 或 pCMVluc 質(zhì)粒脂質(zhì)體。處死動物后，(e) 進(jìn)行熒光素酶活性測定，(F) 用 ELISA 檢測血清中 TNF-α 的含量。

 

在后續(xù)研究中，Katalin Karikó 和 Drew Weissman 還證明了相比未修飾的  mRNA，修飾后的 mRNA 在實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)具有更高的翻譯能力，可以顯著增加蛋白合成[4]。
至此 mRNA 臨床應(yīng)用中的關(guān)鍵障礙被突破。諾貝爾委員會也正是基于 Katalin Karikó 和 Drew Weissman 這些開創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)將今年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎授予他們。

 

目前在臨床前試驗(yàn)和臨床使用中的大多數(shù) mRNA 疫苗都是通過向皮膚、肌肉或皮下間隙內(nèi)注射，在那里它們被免疫或非免疫細(xì)胞吸收并轉(zhuǎn)化為抗原，向 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞展示，具體過程如下：
(1) 注射的 mRNA 疫苗被抗原提呈細(xì)胞內(nèi)吞。
(2) mRNA 脫離內(nèi)涵體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，被核糖體翻譯成蛋白質(zhì)。翻譯后的抗原蛋白可以通過多種方式刺激免疫系統(tǒng)。
(3) 胞內(nèi)抗原被蛋白酶體分解成更小的片段，這些片段在細(xì)胞表面被 Ⅰ 類主要組織相容性復(fù)合體 (MHC I) 展示給細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞。
(4) 活化的細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞通過分泌穿孔蛋白和顆粒酶等溶細(xì)胞分子殺死受感染的細(xì)胞。
(5) 此外，分泌的抗原可以在核內(nèi)體內(nèi)降解，并通過 MHC II 類蛋白在細(xì)胞表面呈現(xiàn)給輔助T細(xì)胞。
(6) 輔助性 T 細(xì)胞通過刺激 B 細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體，并通過炎癥細(xì)胞因子激活吞噬細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞，促進(jìn)循環(huán)病原體的清除。

圖 4. mRNA 疫苗引起免疫反應(yīng)的機(jī)制示意]圖^[1]。

▐  mRNA 疫苗用于癌癥治療
mRNA 疫苗在傳染性疾病防治領(lǐng)域的成功激發(fā)了人們對 mRNA 疫苗在癌癥免疫治療領(lǐng)域的應(yīng)用的興趣 (表 1)[5]。一是通過表達(dá)缺失或改變的腫瘤抑制蛋白來修改免疫抑制腫瘤微環(huán)境。二是 mRNA 疫苗訓(xùn)練免疫系統(tǒng)尋找并殺死癌細(xì)胞。

不過，癌癥 mRNA 疫苗的開發(fā)面臨著許多必須解決的挑戰(zhàn)，傳染性疾病的預(yù)防性疫苗對感染的保護(hù)很大程度上是由強(qiáng)大的體液反應(yīng)賦予的，而癌癥 mRNA 疫苗還必須確保誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性 CD8⁺ T 細(xì)胞反應(yīng)來除去癌細(xì)胞。此外，由于腫瘤相關(guān)抗原在不同個體之間具有高度可變性，因此選擇能夠誘導(dǎo)足夠腫瘤特異性免疫反應(yīng)的抗原也是需要解決的難題。即使抗原能夠誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，抑制性腫瘤微環(huán)境也可以阻止 T 細(xì)胞浸潤到腫瘤中，并可能導(dǎo)致 T 細(xì)胞衰竭。
 

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帽類似物 使用帽類似物是體外合成 5’加帽 mRNA 最常用的方法。帽子結(jié)構(gòu)的存在賦予了 mRNA 的穩(wěn)定性，使其能夠翻譯。

m7GpppA diammonium 一種二核苷酸帽類似物，可用于體外 RNA 轉(zhuǎn)錄。

3'Ome-m7GpppAmpG ammonium 一種含有鎖核酸的三核苷酸帽類似物，可用于體外 RNA 轉(zhuǎn)錄。

 

[1] Chaudhary N, et al. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation [published correction appears in Nat Rev Drug Discov. 2021 Sep 21;:]. Nat Rev Drug Discov. 2021;20(11):817-838. 
 
[2] Hou X, et al. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 2021;6(12):1078-1094. 
 
[3] Karikó K, et al. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005;23(2):165-175. 
 
[4] Karikó K, et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Mol Ther. 2008;16(11):1833-1840. 
 
[5] Barbier AJ, et al. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nat Biotechnol. 2022;40(6):840-854.