隨著銅死亡機制的確立[1][2]，相關研究也愈發(fā)受到各大期刊的 “寵愛”，往期小 M 為大家介紹過其詳細機制及與其他已知細胞程序性死亡的區(qū)別 (詳見往期推文：空降"熱搜" 銅死亡丨解鎖細胞死亡新方式; 熱度 “蹭蹭蹭”的銅死亡，你了解多少？)。

然而最吸引人的便是借助銅死亡這把利劍，刺向腫瘤細胞！那么今天這期銅死亡 “爆紅” 的背后故事就從腫瘤細胞的銅穩(wěn)態(tài)開始吧~

▐  腫瘤細胞的銅穩(wěn)態(tài)

銅是人體所需必需酶的輔助因子，可通過跨濃度梯度作用維持其穩(wěn)態(tài)。通常情況下，細胞內銅濃度保持在極低水平，在癌細胞中也是如此，銅離子的正常功能依賴于集中不同類型蛋白質的相互作用：銅經由血液系統(tǒng)運輸，被轉送到細胞表面。Cu2+ 會被膜表面 STEAP 蛋白催化還原為 Cu+，而具備更強的細胞毒性。進入細胞的銅離子，依次通過 COX17 和 SLC25A3 穿過線粒體外膜和線粒體內膜，進入線粒體基質。
當然，還在細胞質的銅離子也會與銅離子螯合劑 GSH 和 MT 結合，中和銅的細胞毒性，或被銅離子伴侶 CCS 攜帶至 SOD1，調節(jié)細胞內活性氧平衡，多種環(huán)節(jié)共同參與細胞銅穩(wěn)態(tài)的調節(jié)[2]。

圖 1. 腫瘤細胞中銅離子的穩(wěn)態(tài)調節(jié)^[2]。

▐  銅的穩(wěn)態(tài)失調
銅穩(wěn)態(tài)的失調會導致細胞代謝紊亂。當銅離子因離子載體或轉運蛋白過度積累后，一方面，FDX1 將 Cu2+ 還原成更具毒性的 Cu+，抑制線粒體呼吸相關的鐵硫簇蛋白 (Fe-S Cluster) 的合成，引起蛋白質毒性應激反應，最終導致細胞死亡[1]。
 
另一方面，FDX1 作為蛋白質硫辛�；�修飾的上游調節(jié)因子，參與調節(jié) DLAT 的硫辛�；�[1][3]。Cu2+ 可以直接結合并誘導 DLAT 的異聚化，這種不溶性 DLAT 的增加導致細胞蛋白毒性應激，誘導細胞死亡。

圖 2. 銅誘導的細胞死亡的示意圖^[3]。

 

 
腫瘤治療的戰(zhàn)斗向來困難重重，銅死亡的研究為其提供了一種新的殺死腫瘤的方式。那么如何觸發(fā)銅死亡這一利器為我們所用呢？
總的來說，可以通過提高細胞內游離銅離子濃度，從銅的吸收、輸出和儲存等方面來觸發(fā)銅死亡。銅離子進出細胞由銅離子轉運蛋白 SLC31A1 和 ATP7B 控制�？赏ㄟ^：
(1) 過表達 SLC31A1，攝取更多銅離子；
(2) 敲低 ATP7B，減少銅外流，調節(jié)細胞內銅離子濃度；
(3) 利用銅離子載體如 Elesclomol  和 Disulfiram ，將細胞外 Cu2+ 直接運輸到細胞內； 
(4) 通過使用丁硫氨酸亞磺酰亞胺(BSO) 消耗內源性細胞內銅螯合劑谷胱甘肽 (GSH)，避免 GSH 螯合游離銅離子。

圖 3. 提高細胞內游離銅離子濃度的 4 種方式^[2]。

 
由此，過量的 Cu2+ 或其更具毒性的還原態(tài) Cu2+ 輸入細胞，通過與硫辛�；�的 DLAT 結合，進一步導致 DLAT 寡聚化。同時，Cu 還誘導 Fe-S 穩(wěn)定性降低或 Npl4-p97 失活，產生專屬銅誘導機制的細胞死亡[4]。

當然，銅死亡的研究必不可少的便是相關指標檢測！其主要包括：
(1) 形態(tài)學觀測，如質膜破裂，線粒體破裂等；
(2) 相關標志物檢測，如 Fe-S 簇蛋白 FDX1 和 LIAS 是銅死亡的標志，DLAT 和 DLST 的脂�；�的減少和 HSP70 水平增加，產生蛋白毒性應激并最終導致細胞死亡；
(3) 代謝指標檢測，如銅離子積累，α-酮戊二酸的積累，以及琥珀酸減少。
表 1. 銅死亡相關檢測指標。

NP@ESCu: 一種納米顆粒，包含 Elesclomol, Cu 等。

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▐  (一) 形態(tài)學檢測
銅死亡的主要形態(tài)學表現(xiàn)是線粒體皺縮、細胞膜破裂、內質網損傷和染色質破裂等[3]。
Guang Zhao 等人在研究銅積累與視網膜發(fā)育畸形和疾病之間關系時，測量了銅過量時胚胎的形態(tài)學特征 (圖 4 E)。TEM 分析顯示，銅處理的胚胎視網膜細胞的內質網和線粒體結構被破壞。與對照組相比，在銅處理視網膜細胞中，線粒體內膜減少并產生大液泡 (E1-E3, 紅色)，內質網形成松散結構 (E4-E6, 綠色)[12]。

圖 4. 銅處理后對視網膜細胞的 TEM 分析^[12]。

▐  (二) 標志物檢測

研究發(fā)現(xiàn)，銅離子載體 Elesclomol 在心肌細胞中誘導銅死亡，其特征是 Fe-S 簇蛋白的減少和線粒體酶脂酰化的減少。
Int J Mol Sci 發(fā)表的 “探究銅死亡對糖尿病心肌病中 AGEs 誘導的心肌細胞功能障礙的潛在影響” 中，作者通過 Western Blot 檢測了 ES-Cu 誘導肌細胞發(fā)生銅凋亡后的標志性變化。

結果表明，多種線粒體 Fe-S 簇蛋白如 FDX1、LIAS、ACO2、ETFDH 和 NDUFV1 等，均下調表達 (圖 5A)；DLAT 和 DLST 蛋白質脂�；瘻p少 (圖 5B)。此外，作者對糖尿病 (db/db) 小鼠心肌組織中 Fe-S 簇蛋白進行蛋白質印跡分析(圖 5C-D)，發(fā)現(xiàn) db/db 小鼠的心臟中 Fe-S 簇蛋白 FDX1、LIAS、NDUFS8 和 ACO2 丟失，且 HSP70 豐度增加[8]。

 

▐  (三) 代謝指標檢測

FDX1 的功能取決于丙酮酸和 α-酮戊二酸積累、避免琥珀酸的消耗，從而保證 PDH 和 α-酮戊二酸脫氫酶的 TCA 循環(huán)，導致蛋白質脂肪酰化[1]。Tian 等人利用設計了一種納米佐劑 CS/MTO-Cu@AMI，其中包含 MTO 、Cu2+ 和外泌體分泌抑制劑 AMI 等 (圖 6A)。
為了驗證銅死亡，作者分析了 HSP 70 和 LIAS 的表達，并檢測了三羧酸循環(huán)中關鍵代謝物的變化。結果表明，CS/MTO-Cu@AMI 處理顯著促進 HSP 70 的表達，同時下調 LIAS 的表達 (圖中未顯示)。此外，與對照組相比，CS/MTO-Cu@AMI 組三羧酸循環(huán)中的丙酮酸和 α-酮戊二酸含量均增加了 40%，而琥珀酸含量下降了 45% (圖 6B-D)，有力地支持 CS/MTO-Cu@AMI 可以有效誘導銅死亡[10]。

圖 6. 不同處理后細胞的琥珀酸, α-酮戊二酸, 丙酮酸的相對水平^[10]。

 

 Tips：

納米佐劑 CS/MTO-Cu@AMI：Cu2+ 有效地觸發(fā)銅死亡誘導的線粒體功能障礙，激活 AMPK 途徑介導的 PD-L1 蛋白降解，剝奪巨噬細胞和外泌體釋放的能量供應，放大細胞內細菌滅活的氧化應激，從而在體外和體內有效地增敏化療并激活全身抗腫瘤免疫。

 

本期小 M 為大家介紹了腫瘤細胞中銅的穩(wěn)態(tài)調節(jié)，可從銅的吸收、輸出和儲存等方面采取多種措施提高細胞內游離銅離子濃度，進而觸發(fā)銅死亡，與腫瘤發(fā)展做斗爭！此外，小 M 還為大家整理了銅死亡的相關檢測指標和方法，方便大家的實驗研究~

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Elesclomol (STA-4783) 是一種銅離子載體，能夠特異性結合鐵氧還蛋白 1 (FDX1) α2/α3 螺旋和 β5 鏈，抑制 FDX1 介導的 Fe-S 簇生物合成，促進銅死亡。

Disulfiram 是一種銅離子載體和 ALDH1 抑制劑，對酒精具有急性敏感性。它可增加細胞內 ROS 水平，誘導銅死亡。

Cu(II)GTSM 是一種銅復合物，具有細胞通透性。它可顯著抑制 GSK3β、Amyloid-β 寡聚體 (AβOs)，降低 tau 磷酸化。

Penicillamine 是一種重金屬螯合劑，是 Penicillin 的代謝降解產物。它可增加游離銅，增強氧化應激。

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[1] Tsvetkov P, et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins. Science. 2022 Mar 18;375(6586):1254-1261. 
 
[2] Xie J, et al. Cuproptosis: mechanisms and links with cancers. Mol Cancer. 2023 Mar 7;22(1):46. 
 
[3] Wang Y, et al. Cuproptosis: a new form of programmed cell death. Cell Mol Immunol. 2022 Aug;19(8):867-868. 
 
[4] Skrott Z, et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 2017 Dec 14;552(7684):194-199. 
 
[5] Guo B, et al. Cuproptosis Induced by ROS Responsive Nanoparticles with Elesclomol and Copper Combined with αPD-L1 for Enhanced Cancer Immunotherapy. Adv Mater. 2023 Jun;35(22):e2212267. 
 
[6] Wu H, et al. Copper sulfate-induced endoplasmic reticulum stress promotes hepatic apoptosis by activating CHOP, JNK and caspase-12 signaling pathways. Ecotoxicol Environ Saf. 2020 Mar 15;191:110236. 
 
[7] Yang W, et al. 4-Octyl itaconate inhibits aerobic glycolysis by targeting GAPDH to promote cuproptosis in colorectal cancer. Biomed Pharmacother. 2023 Mar;159:114301. 
 
[8] Huo S, et al. ATF3/SPI1/SLC31A1 Signaling Promotes Cuproptosis Induced by Advanced Glycosylation End Products in Diabetic Myocardial Injury. Int J Mol Sci. 2023 Jan 14;24(2):1667. 
 
[9] Xu Y, et al. An Enzyme-Engineered Nonporous Copper(I) Coordination Polymer Nanoplatform for Cuproptosis-Based Synergistic Cancer Therapy. Adv Mater. 2022 Oct;34(43):e2204733.
 
[10] Tao X, et al. A tandem activation of NLRP3 inflammasome induced by copper oxide nanoparticles and dissolved copper ion in J774A.1 macrophage. J Hazard Mater. 2021 Jun 5;411:125134. 
 
[11] Tian H, et al. Clinical Chemotherapeutic Agent Coordinated Copper‐Based Nanoadjuvants for Efficiently Sensitizing Cancer Chemo‐Immunotherapy by Cuproptosis‐Mediated Mitochondrial Metabolic Reprogramming[J]. Advanced Functional Materials, 2023: 2306584. 
 
[12] Zhao G, et al. Copper induce zebrafish retinal developmental defects via triggering stresses and apoptosis. Cell Commun Signal. 2020 Mar 14;18(1):45.