轉(zhuǎn)染的分類、應(yīng)用場景、實驗步驟及細胞類型介紹
一、引言
轉(zhuǎn)染是分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)研究的重要技術(shù)，它允許我們向細胞引入外源基因，從而進行基因功能研究、基因表達調(diào)控，或是進行基因治療等。本文將詳細介紹轉(zhuǎn)染的概念、分類、應(yīng)用場景、步驟，常用于轉(zhuǎn)染的細胞類型、以及大家常用試劑等方面來介紹此技術(shù)。
二、轉(zhuǎn)染概念
轉(zhuǎn)染，顧名思義，是指將某種物質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)。在生物醫(yī)學(xué)研究中，這個“物質(zhì)”通常指的是DNA或RNA。通過轉(zhuǎn)染，我們可以向細胞引入新的基因，或者沉默或敲低細胞內(nèi)的某個基因，從而研究該基因?qū)毎顒拥挠绊憽?/span>
三、轉(zhuǎn)染的分類
根據(jù)轉(zhuǎn)染物質(zhì)的種類，轉(zhuǎn)染可分為DNA轉(zhuǎn)染和RNA轉(zhuǎn)染。
DNA轉(zhuǎn)染是指將外源DNA分子導(dǎo)入真核細胞的過程，它是真核細胞主動或被動導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過程。通常用于基因表達和蛋白質(zhì)合成的研究。
而RNA轉(zhuǎn)染指將RNA分子導(dǎo)入細胞的過程，則主要用于干擾RNA的研究，以探究特定基因的功能。
根據(jù)轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性和效率，轉(zhuǎn)染又可以分為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時轉(zhuǎn)染。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是指外源基因（DNA/RNA）整合到宿主基因組上，并能穩(wěn)定遺傳給后代，這多用于長期觀察基因?qū)τ诩毎δ艿挠绊懸约暗鞍字g的相互作用。
瞬時轉(zhuǎn)染則是指外源基因（DNA/RNA）不整合到宿主基因組上，僅在細胞分裂周期內(nèi)表達，主要用于啟動子和其他調(diào)控原件的分析以及蛋白質(zhì)的功能研究。
兩者的實驗步驟相似，但在實驗操作上有一定的差異。
首先，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時轉(zhuǎn)染所使用的轉(zhuǎn)染試劑不同。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染通常使用脂質(zhì)體等試劑，通過細胞內(nèi)吞作用將外源基因整合到細胞基因組中。這些試劑可以促進外源基因與細胞表面的受體結(jié)合，從而實現(xiàn)基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。而瞬時轉(zhuǎn)染則是使用聚凝胺等試劑進行轉(zhuǎn)染，雖然這些試劑也可以促進外源基因進入細胞，但它們不會將基因整合到細胞基因組中。
其次，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時轉(zhuǎn)染對外源基因的要求也不同。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染通常需要使用具有復(fù)制能力的質(zhì)�；虿《据d體，以便外源基因可以在細胞內(nèi)穩(wěn)定存在并整合到細胞基因組中。而瞬時轉(zhuǎn)染則不需要使用具有復(fù)制能力的載體，因為外源基因只是短暫地表達，拷貝數(shù)會被稀釋，無法達到持續(xù)表達外源基因的目的。
根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑的不同，可分為：化學(xué)轉(zhuǎn)染、物理轉(zhuǎn)染、病毒轉(zhuǎn)染。
化學(xué)轉(zhuǎn)染：通過使用一些化學(xué)物質(zhì)，如聚乙烯亞胺（PEI）、脂質(zhì)體等，來改變細胞膜的物理和化學(xué)性質(zhì)，使其對外源性DNA或RNA具有親和力，從而實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。這種方法的優(yōu)點在于可以通過控制化學(xué)物質(zhì)的濃度和作用時間等因素來精確控制轉(zhuǎn)染的效率和時間。
物理轉(zhuǎn)染：包括基因槍法和電擊法�；驑尫ɡ酶咚龠\動的粒子，將DNA或RNA撞擊到細胞膜上，從而進入細胞。電擊法是在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質(zhì)粒進入（實驗條件控制較嚴、難度較大）。物理轉(zhuǎn)染的優(yōu)點在于可以直接將DNA或RNA導(dǎo)入到細胞內(nèi)，而不需要使用任何化學(xué)物質(zhì)。
病毒轉(zhuǎn)染：利用病毒作為載體，將外源基因包裝后導(dǎo)入細胞。這種方法可以有效地實現(xiàn)外源基因的穩(wěn)定整合和表達，同時具有較高的轉(zhuǎn)染效率和安全性。常用的病毒載體包括腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等。病毒轉(zhuǎn)染的優(yōu)點在于可以實現(xiàn)高效、特異性的基因轉(zhuǎn)移，同時避免使用某些化學(xué)物質(zhì)對細胞產(chǎn)生的負面影響。
四、轉(zhuǎn)染應(yīng)用場景
1.在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，轉(zhuǎn)染技術(shù)的主要應(yīng)用包括：
基因功能研究：通過轉(zhuǎn)染技術(shù)將外源基因?qū)爰毎芯吭摶蛟诩毎械墓δ�、表達調(diào)控、亞細胞定位等。
基因敲除和沉默：通過轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入含有特定基因敲除或沉默序列的質(zhì)粒，研究特定基因的敲除或沉默對細胞生長、分化、凋亡等的影響。
病毒感染研究：將病毒基因?qū)爰毎�，研究病毒感染細胞的機制、抗病毒藥物的作用機理等。
細胞分化和命運決定：通過轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入與細胞分化命運相關(guān)的基因或調(diào)控元件，研究細胞的分化、凋亡、自噬等過程。
腫瘤研究：將與腫瘤相關(guān)的基因?qū)肽[瘤細胞系，研究腫瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤耐藥性、腫瘤免疫等。
2.在藥物研發(fā)和生產(chǎn)中，轉(zhuǎn)染技術(shù)的主要應(yīng)用包括：
疫苗生產(chǎn)：將病毒抗原基因?qū)牒线m的細胞系，通過轉(zhuǎn)染技術(shù)獲得可表達病毒抗原的細胞系，用于制備疫苗。例如，將病毒抗原基因?qū)肜ハx細胞中，可以生產(chǎn)出高效、安全的病毒疫苗。
基因治療：將治療性基因（如治療性siRNA、質(zhì)粒DNA等）導(dǎo)入靶細胞，通過轉(zhuǎn)染技術(shù)實現(xiàn)基因治療。例如，將特定基因?qū)胄募〖毎校梢灾委熯z傳性心臟病或心肌梗死等疾病。
藥物篩選：通過轉(zhuǎn)染技術(shù)將藥物靶點基因?qū)爰毎�，用于篩選能夠與藥物靶點結(jié)合的藥物候選物。
生產(chǎn)細胞系：在生產(chǎn)重組蛋白藥物、抗體藥物等過程中，通過轉(zhuǎn)染技術(shù)將目的基因?qū)肷a(chǎn)細胞系，獲得可穩(wěn)定表達目的藥物的細胞系。
總之，轉(zhuǎn)染技術(shù)在生命科學(xué)研究領(lǐng)域和藥物研發(fā)、新藥開發(fā)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，為研究基因功能、疾病治療和新藥開發(fā)提供了有效的工具和方法。
五、轉(zhuǎn)染步驟
1.以下是較為常見的一種轉(zhuǎn)染方法的步驟：
☆ 準備細胞：選擇適當(dāng)類型的細胞進行轉(zhuǎn)染，并在轉(zhuǎn)染前進行適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)，確保細胞處于對轉(zhuǎn)染最有利的狀態(tài)。
☆ 準備基因：將目的基因以合適的方式進行剪切和標記，以便于后續(xù)的檢測和篩選。
☆ 制備轉(zhuǎn)染載體：選擇適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染載體，如脂質(zhì)體、病毒等，將目的基因包裹在轉(zhuǎn)染載體中（這個步驟是載體構(gòu)建，將目的基因插入到轉(zhuǎn)染載體中，形成重組目的基因片段，并利用這種重組片段轉(zhuǎn)染目標細胞，從而將目的基因?qū)爰毎校?/span>
☆ 進行轉(zhuǎn)染：按照生產(chǎn)商提供的標準操作流程，將轉(zhuǎn)染載體導(dǎo)入受體細胞。
☆ 確認轉(zhuǎn)染效果：通過特定的檢測方法，如熒光染色、免疫細胞化學(xué)、Western blot等，確認目的基因是否成功轉(zhuǎn)入受體細胞中。
☆ 篩選和克隆：對于需要進一步克隆和擴增的細胞，可以通過特定的篩選方法，如抗生素篩選、熒光篩選等，對細胞進行篩選和克隆。
☆ 擴大培養(yǎng)：將篩選出的細胞進行擴大培養(yǎng)，以便獲得更多的細胞用于后續(xù)的實驗或生產(chǎn)。
☆ 功能驗證：在進行基因轉(zhuǎn)染后，需要通過特定的功能驗證方法，如ELISA、細胞活性檢測、Western blot等，確認目的基因是否成功表達并發(fā)揮作用。
注意：轉(zhuǎn)染載體是指在基因轉(zhuǎn)染過程中，用于幫助目的基因進入宿主細胞的一些輔助因子。這些載體可以是質(zhì)粒、病毒、人工染色體或其他能自主復(fù)制的DNA分子。
在轉(zhuǎn)染過程中，目的基因通常被插入到載體中，以便于將其導(dǎo)入宿主細胞。載體可以將目的基因帶到細胞內(nèi)部，并確保其在細胞內(nèi)穩(wěn)定存在和表達。常見的轉(zhuǎn)染載體包括質(zhì)粒、噬菌體、反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒等。
其中，質(zhì)粒是最常用的一種轉(zhuǎn)染載體，它是一種小型環(huán)狀DNA分子，可以在細胞內(nèi)自主復(fù)制。噬菌體則是一種病毒，它能夠?qū)⑵溥z傳物質(zhì)插入到細菌細胞中，并利用細菌的細胞器進行自我復(fù)制。反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒則可以感染哺乳動物細胞，將外源性基因?qū)爰毎麅?nèi)進行表達。
2.siRNA轉(zhuǎn)染步驟
① 以下是siRNA轉(zhuǎn)染至受體細胞的步驟：
☆ 設(shè)計siRNA：首先，需要基于目標基因序列設(shè)計siRNA�？梢允褂迷诰�工具或商業(yè)實驗室進行設(shè)計（Like us）。一般建議設(shè)計2-3條siRNA并進行驗證，以確保特異性和有效性。
☆ 合成siRNA：將設(shè)計好的siRNA通過化學(xué)合成方法制備出來，并進行純化和濃縮。通常選擇購買現(xiàn)成的siRNA（We have what you want），也可以使用自行合成的siRNA。
☆ 細胞培養(yǎng)：將所需的受體細胞培養(yǎng)到適當(dāng)?shù)臄?shù)量和密度。在轉(zhuǎn)染前應(yīng)確保細胞處于快速增長期，并且細胞狀態(tài)良好。
☆ 轉(zhuǎn)染siRNA：根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書或?qū)嶒炇覙藴什僮髁鞒蹋瑢iRNA轉(zhuǎn)染到受體細胞中。☆ 鑒定：轉(zhuǎn)染后需要對細胞進行恢復(fù)培養(yǎng)，通常24-48小時后可以進行下一步操作。
② siRNA概念及轉(zhuǎn)染作用
siRNA，即小干擾RNA，是一種長度約為21-25個核苷酸的雙鏈RNA分子。
在轉(zhuǎn)染這一步驟中，siRNA發(fā)揮的作用是誘導(dǎo)靶基因的沉默，進而抑制蛋白的表達。具體來說，當(dāng)siRNA進入細胞后，它能夠與細胞內(nèi)的mRNA（信使RNA）結(jié)合，導(dǎo)致信使RNA的降解，從而阻止特定蛋白質(zhì)的翻譯。由于這種機制，siRNA在基因治療和藥物研發(fā)中具有廣泛的應(yīng)用前景，包括但不限于基因沉默、基因敲除、基因修飾、病毒抑制、細胞治療以及疫苗研發(fā)等。
3.其余轉(zhuǎn)染的基因類型
① miRNA的概念及轉(zhuǎn)染作用
miRNA是一種非編碼RNA，它通常由約20-25個核苷酸組成，并在真核生物中廣泛存在。miRNA的主要功能是在細胞中調(diào)節(jié)基因表達。它們通過與靶標mRNA相結(jié)合，引發(fā)一系列的生物學(xué)過程，如抑制mRNA的翻譯或促進mRNA的降解。通過這種方式，miRNA能夠?qū)Χ喾N基因的表達進行精確的調(diào)控，影響細胞的生長、分化、代謝和發(fā)育等重要過程。
在轉(zhuǎn)染至受體細胞中，miRNA的作用主要是調(diào)節(jié)特定基因的表達。它們通過與靶mRNA結(jié)合，影響轉(zhuǎn)錄后基因表達的效率。具體而言，miRNA可以促進靶mRNA的降解，從而降低特定基因的表達水平；也可以抑制靶mRNA的翻譯，進一步減少特定基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。通過這些方式，miRNA能夠精細地調(diào)控細胞內(nèi)的基因表達過程。
miRNA在許多生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，包括細胞周期調(diào)控、細胞分化、免疫應(yīng)答、發(fā)育調(diào)節(jié)等。同時，異常的miRNA表達與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，如癌癥、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。因此，miRNA在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中具有重要的價值和潛在的臨床應(yīng)用前景。
② mRNA概念及轉(zhuǎn)染作用
mRNA，全稱為信使RNA，是由DNA上的基因信息轉(zhuǎn)錄而來的一種核酸分子。在細胞內(nèi)，mRNA負責(zé)將DNA上的遺傳信息轉(zhuǎn)錄成可讀取的RNA序列，并傳遞給核糖體，以便合成蛋白質(zhì)。
mRNA的轉(zhuǎn)染作用是指將體外合成的mRNA通過某種方式導(dǎo)入到細胞內(nèi)，利用細胞內(nèi)的翻譯系統(tǒng)將mRNA翻譯成目標蛋白質(zhì)。這種技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，如mRNA疫苗的研發(fā)和mRNA藥物的生產(chǎn)。
通過mRNA疫苗的研發(fā)，可以讓人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對病毒的免疫力，達到預(yù)防病毒感染的目的。此外，利用mRNA編程的細胞外包裝體可以用來治療癌癥等疾病。這些外表皮體可以將mRNA輸送到病變區(qū)域，從而激活免疫系統(tǒng)并促進治療的效果。
在轉(zhuǎn)染過程中，mRNA需要被加工和修飾，以確保其穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)表達效率和正確的亞細胞定位。這些加工過程包括5'端帽子修飾、3'端多聚腺苷酸尾巴的形成等。
相較于其他技術(shù)如蛋白質(zhì)技術(shù)、基因組編輯技術(shù)等，mRNA技術(shù)具有高效性、安全性、制備簡單、生產(chǎn)周期短、成本低等優(yōu)點。因此，基于mRNA技術(shù)開發(fā)的各種疫苗及藥物將會是生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展方向。
六、常用于轉(zhuǎn)染的細胞
常用于轉(zhuǎn)染的細胞包括原代細胞、原代細胞衍生物、腫瘤細胞系、幼倉鼠腎細胞（BHK-21）、人胚腎細胞（HEK-293）、人胚肺細胞（HEL）、人肺癌細胞（A549）、人乳腺癌細胞（MCF-7）、人宮頸癌細胞（HeLa）、人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）、大鼠肝細胞、神經(jīng)元細胞等。
人胚胎腎細胞（HEK293）：這種細胞系具有高轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性的特點，常用于基因克隆和疫苗生產(chǎn)。
人宮頸癌細胞（HeLa）：這種細胞系具有高分裂速度和穩(wěn)定性的特點，常用于基因功能研究和蛋白質(zhì)生產(chǎn)。
人骨髓瘤細胞（U266）：這種細胞系具有高分化度和穩(wěn)定性的特點，常用于基因克隆和藥物篩選。
小鼠胚胎成纖維細胞（NIH3T3）：這種細胞系具有低免疫原性和高分裂速度的特點，常用于基因敲除和藥物篩選。
大鼠膠質(zhì)瘤細胞（C6）：這種細胞系具有高分化度和穩(wěn)定性的特點，常用于藥物篩選和腫瘤研究。
需要注意的是，不同的細胞類型具有不同的轉(zhuǎn)染效率和特點，實驗人員需要根據(jù)具體實驗需求和細胞特點選擇適合的轉(zhuǎn)染方法和技術(shù)。
