文章題目：Analysis of donor pancreata defines the transcriptomic signature and microenvironment of early neoplastic lesions

中文題目：供體胰腺的分析定義了早期腫瘤病變的轉(zhuǎn)錄組特征和微環(huán)境

見刊時(shí)間：2023.06

期刊名稱：Cancer Discovery

影響因子：28.2

實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：scRNA-seq (10x Genomics)、GeoMx DSP（NanoString）

DOI：10.1158/2159-8290.CD-23-0013
 

技術(shù)路線

文章摘要

由于缺乏在沒有疾病和死后快速降解的情況下從胰腺獲取組織的跡象，因此對(duì)成人健康胰腺的研究很少。研究者從腦死亡捐獻(xiàn)者那里獲得胰腺，從而避免了任何熱缺血時(shí)間。這 30 名捐贈(zèng)者年齡和種族各不相同，并且沒有已知的胰腺疾病。對(duì)樣本的組織病理學(xué)分析顯示，無論年齡如何，大多數(shù)個(gè)體都存在胰腺上皮內(nèi)瘤變（PanIN）病變。通過結(jié)合多重 IHC、單細(xì)胞 RNA 測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，他們首次對(duì)成人胰腺的獨(dú)特微環(huán)境和散發(fā)性 PanIN 病變進(jìn)行了表征。他們將健康胰腺與胰腺癌和瘤周組織進(jìn)行比較，觀察到成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中不同的轉(zhuǎn)錄組特征。來自健康胰腺的 PanIN 上皮細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄上與癌細(xì)胞非常相似，這表明腫瘤途徑在腫瘤發(fā)生的早期就開始了。
 

 文章結(jié)果 

1、成人胰腺經(jīng)常出現(xiàn) PanIN 病變

研究者從健康成人器官捐贈(zèng)者那里收集了 30 個(gè)胰腺。每個(gè)塊的組織病理學(xué)分析揭示了 30 個(gè)供體標(biāo)本中的 18 個(gè)存在 PanIN以及正常腺泡實(shí)質(zhì)、正常導(dǎo)管和腺泡到導(dǎo)管化生區(qū)域（ADM）。

圖1 成人胰腺經(jīng)常出現(xiàn) PanIN 病變

 

2、來自健康個(gè)體的 PanIN 被獨(dú)特的微環(huán)境包圍

為了表征 PanIN 微環(huán)境的免疫和基質(zhì)組成，研究者對(duì)福爾馬林固定、石蠟包埋的組織進(jìn)行了多重?zé)晒饷庖呓M織化學(xué)分析。研究者將 PanIN 等區(qū)域的細(xì)胞組成與正常腺泡、導(dǎo)管或 ADM 等區(qū)域進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，PanIN 的形成伴隨著富含成纖維細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和 T 細(xì)胞的獨(dú)特微環(huán)境的建立，這與組織學(xué)上正常的胰腺不同。

為了進(jìn)一步了解 PanIN 的組成及其微環(huán)境，研究者對(duì) 6 個(gè)供體器官（總共 44,068 個(gè)細(xì)胞）進(jìn)行了單細(xì)胞 RNA 測(cè)序。組織學(xué)分析顯示，4 個(gè)胰腺存在 PanIN 病變，而其余兩個(gè)胰腺未檢測(cè)到病變。研究者對(duì)其中骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞進(jìn)行了進(jìn)一步分析。多重免疫熒光數(shù)據(jù)顯示，巨噬細(xì)胞存在于整個(gè)組織中，而 T 細(xì)胞更有可能位于 PanIN 附近。隨后研究者又一起分析了成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞。最后研究者得出結(jié)論，無論是微環(huán)境的免疫成分還是非免疫成分，在供體樣本中都是不同的。正常胰腺包括一組異質(zhì)結(jié)構(gòu)細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以及免疫細(xì)胞。正常人類胰腺還呈現(xiàn)出組織學(xué)異質(zhì)性，反映了年齡以及人類生活方式和遺傳學(xué)的復(fù)雜性。

圖2 健康胰腺中的 PanIN 病變被獨(dú)特的微環(huán)境包圍

圖3 健康的胰腺含有多種非上皮細(xì)胞群，包括骨髓細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞

 

3.健康胰腺和胰腺腫瘤微環(huán)境的比較揭示了不同的基質(zhì)特征

研究者接下來研究正常胰腺和胰腺癌微環(huán)境的差異。為此，他們將來自健康供體樣本（6 個(gè)胰腺；總共11 個(gè)樣本）的單細(xì)胞 RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)與從數(shù)據(jù)庫下載的數(shù)據(jù)進(jìn)行了整合。先前發(fā)布的腫瘤 (n=16) 和鄰近正常 (n=3) 樣本的數(shù)據(jù)集。結(jié)果顯示，腫瘤樣本中巨噬細(xì)胞和 CD4+ T 細(xì)胞的比例較高。腫瘤樣本和正常胰腺中細(xì)胞豐度明顯不同。且差異基因分析顯示兩種類型樣本中基因表達(dá)存在明顯差異。研究者繪制了與正常樣本相比腫瘤中增加的細(xì)胞群之間預(yù)測(cè)的配體受體相互作用。結(jié)果檢測(cè)到了促胰腺癌發(fā)生相關(guān)的因子。同時(shí)，研究者進(jìn)一步分析了骨髓細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。細(xì)胞豐度、基因表達(dá)模式以及通路分析提示在健康樣本和腫瘤樣本之間存在明顯差異。這些結(jié)果揭示了微環(huán)境組成部分的差異。

圖4 健康胰腺和胰腺腫瘤微環(huán)境的比較揭示了不同的基質(zhì)特征

圖5 與非腫瘤對(duì)應(yīng)物相比，來自荷瘤胰腺的骨髓細(xì)胞和成纖維細(xì)胞群體表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)錄組特征

 

4.空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示了 PanIN 病變的獨(dú)特上皮基因特征，該特征與腫瘤上皮密切相關(guān)

為了直接評(píng)估 PanIN 的基因表達(dá)模式，他們利用了 GeoMx® Digital Spatial Profiler（DSP） 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)平臺(tái)。研究者從供體胰腺中選擇腺泡、正常導(dǎo)管、ADM 和 PanIN 感興趣區(qū)域 (ROI)。此外，他們還收集了腫瘤附近腺泡和正常導(dǎo)管的 ROI 進(jìn)行比較。為了避免基質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本混淆，使用全細(xì)胞角蛋白 (PanCK) 和 CD45 對(duì)每個(gè)區(qū)域的樣本進(jìn)行分割，以選擇所有 ROI 中的 PanCK+/CD45- 細(xì)胞，但腺泡 ROI 除外，在其中選擇 PanCK-/CD45-（作為腺泡）細(xì)胞不表達(dá) PanCK，并且可以很容易地在組織學(xué)上識(shí)別。研究者提取了每種細(xì)胞類型特有的基因特征�；�因集變異分析 (GSVA)顯示來自其他健康胰腺的散發(fā)性 PanIN 與腫瘤鄰近的 PanIN 相似但又不同。

隨后，研究者將空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)與單細(xì)胞 RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)相結(jié)合。使用每個(gè) ROI 類別的前 20 個(gè)基因，研究者定義了腺泡、導(dǎo)管、ADM、PanIN 和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞類型特異性基因特征，并將這些特征從單細(xì)胞上皮測(cè)序數(shù)據(jù)映射到上皮簇。研究者繪制了每個(gè)定義特征相對(duì)豐富的細(xì)胞群圖。

圖6 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示了 PanIN 病變的獨(dú)特上皮基因特征，該特征與腫瘤上皮密切相關(guān)

 

5.Claudin 18、MUC5AC/B 和 AQP1/3 區(qū)分健康胰腺中的正常導(dǎo)管、ADM 和 PanIN

接下來，研究者驗(yàn)證供體組織中的基因特征，以確定它們是否準(zhǔn)確地識(shí)別了不同的上皮細(xì)胞群，正如上述轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)所表明的那樣。研究者選擇了區(qū)分每種上皮細(xì)胞類型的標(biāo)記，包括 AQP1（ADM 特異性）、MUC5B 和 AQP3（正常導(dǎo)管特異性）以及 CLDN18 和 TFF1（PanIN 特異性）的原位雜交探針。研究者將 MUC5AC 作為 PanIN 標(biāo)記，因?yàn)樗麄兊臄?shù)據(jù)支持其在非腫瘤樣本中 PanIN 中的獨(dú)特表達(dá)（與正常導(dǎo)管、ADM 和腺泡細(xì)胞相比）。結(jié)果顯示，在同時(shí)含有 PanIN 和正常導(dǎo)管的切片中，MUC5B 僅對(duì)正常導(dǎo)管染色，而 MUC5AC 對(duì) PanIN 具有特異性。CLDN18 染色在 PanIN 中升高，但在 ADM 中也呈較低程度的陽性。AQP3 僅對(duì)正常導(dǎo)管染色，而 AQP1 對(duì) ADM 具有特異性。TFF1 與 CLDN18 在 PanIN 中共表達(dá)。最后，PanIN 病變表達(dá)高水平的 p-ERK，而 ADM 區(qū)域的 p-ERK 也呈陽性。因此，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)衍生的特征定義了個(gè)體上皮細(xì)胞群，并正確預(yù)測(cè)了獨(dú)特譜系標(biāo)記的蛋白質(zhì)表達(dá)。

圖7 Claudin 18、MUC5AC/B 和 AQP1/3 區(qū)分健康胰腺中的正常導(dǎo)管、ADM 和 PanIN

 

 文章意義

由于胰腺癌的前驅(qū)病變特征尚不清楚。研究者分析了供體胰腺，發(fā)現(xiàn)前體病變的檢出率遠(yuǎn)高于胰腺癌的發(fā)病率，這為闡明抑制或相反促進(jìn)惡性進(jìn)展的微環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)在因素奠定了基礎(chǔ)。