MeRIP-seq等揭示ALKBH5介導m6A去甲基化調(diào)控皮膚創(chuàng)面再上皮化分子機制
哺乳動物的損傷皮膚屏障完整性恢復通過創(chuàng)面愈合基本機制實現(xiàn)，這是一個包括凝血、炎癥、再上皮化（re-epithelialization）、肉芽組織形成和疤痕重塑的多步驟過程。再上皮化是決定創(chuàng)面成功愈合的重要因素，再上皮化受損是創(chuàng)傷、糖尿病、血管疾病、感染或輻射導致的所有慢性創(chuàng)面無法愈合的原因。因此研究創(chuàng)面再上皮化調(diào)控機制具有重要的臨床意義，并可能為加速創(chuàng)面愈合的治療策略提供新的見解。
N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物中最普遍的內(nèi)部mRNA修飾，哺乳動物m6A修飾受“writers”（如METTL3、METTL14、WTAP）和“erasers”（如FTO、ALKBH5））的動態(tài)和可逆調(diào)控。同時m6A修飾可以被特異性RNA結(jié)合蛋白識別（稱為“readers”，如YTHDF1-3、HNRNP、IGF2BP）。m6A修飾被“readers”蛋白識別后，可以影響RNA代謝的各個方面，包括RNA穩(wěn)定性、翻譯、剪接、易位和高級結(jié)構(gòu)。近年來大量研究表明m6A修飾廣泛參與毛囊形態(tài)發(fā)生、紫外線介導的皮膚損傷、系統(tǒng)性硬化、尋常型銀屑病、增生性瘢痕和腫瘤發(fā)生的調(diào)控。同時，m6A修飾在創(chuàng)面愈合過程中也發(fā)揮著重要作用，然而m6A修飾是否在調(diào)控角質(zhì)形成細胞的遷移能力中發(fā)揮作用仍不清楚。此外對m6A修飾在創(chuàng)面再上皮化中的作用缺乏全面了解。
2023年7月14日，上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復外科Xin Huang、Yixuan Zhao、湖南中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院創(chuàng)面修復科劉代明為共同第一作者，上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復外科昝濤、李青峰、Yixuan Zhao為共同通訊作者， 以“ALKBH5-mediated m6A demethylation fuels cutaneous wound re-epithelialization by enhancing PELI2 mRNA stability”為題在《Inflammation and Regeneration》雜志發(fā)表研究論文，該研究通過甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）和對應的RNA-seq聯(lián)合分析揭示了ALKBH5是創(chuàng)面再上皮化的內(nèi)源性促進因子，提示了開發(fā)針對難治性創(chuàng)面的重編程m6A靶向療法的前景。
標題：ALKBH5-mediated m6A demethylation fuels cutaneous wound re-epithelialization by enhancing PELI2 mRNA stability（ALKBH5介導的m6A去甲基化通過增強 PELI2 mRNA 穩(wěn)定性促進皮膚創(chuàng)面再上皮化）
時間：2023-07-14
期刊：Inflammation and Regeneration
影響因子：IF 8.1
技術(shù)平臺：m6A-seq（MeRIP-seq）、RNA-seq、m6A-RIP-qPCR 、qRT-PCR、Dot-blot、WB/IF等
研究摘要：
創(chuàng)面再上皮化受損會導致皮膚屏障重建功能障礙。m6A RNA修飾參與RNA命運決定，m6A甲基化變異會觸發(fā)許多疾病發(fā)病機制。然而，m6A在創(chuàng)面再上皮化中的作用仍然未知。本研究構(gòu)建ALKBH5-/-小鼠以研究ALKBH5敲除后創(chuàng)面再上皮化率。采用甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）和RNA-seq結(jié)合的高通量測序分析方法鑒定出ALKBH5的下游靶標。通過體外和體內(nèi)挽救實驗（In vitro and in vivo rescue experiments）驗證下游靶標對ALKBH5缺失細胞或動物的功能表型作用。此外，通過RIP-qPCR、RNA下拉和RNA穩(wěn)定性分析揭示了互作的reader蛋白和調(diào)控機制。
研究結(jié)果表明，ALKBH5在創(chuàng)緣表皮中特異性上調(diào)。ALKBH5敲除抑制了ALKBH5-/-小鼠的角質(zhì)形成細胞（keratinocytes）遷移，并導致創(chuàng)面再上皮化延遲。綜合高通量分析揭示E3泛素蛋白連接酶PELI2是ALKBH5的下游靶標。體外和體內(nèi)挽救實驗結(jié)果表明，外源性PELI2補充可以在體內(nèi)和體外部分挽救ALKBH5缺失細胞中的角質(zhì)形成細胞遷移并加速再上皮化。從機制上來說，ALKBH5通過去除PELI2 mRNA中的m6A修飾來促進PELI2表達，并以YTHDF2依賴的方式增強其穩(wěn)定性。
圖形摘要
研究結(jié)果
（1）在創(chuàng)緣的角質(zhì)形成細胞（keratinocytes）中觀察到RNA m6A修飾減少和ALKBH5表達增加
圖1：健康創(chuàng)面邊緣角質(zhì)形成細胞中RNA m6A修飾降低，ALKBH5表達增加。
a. 在小鼠背部產(chǎn)生直徑5 mm的全層皮膚創(chuàng)面，切除肉脂膜下方筋膜(紅虛線)以防止創(chuàng)面收縮。
b. 傷后2 d (PWD2)皮膚創(chuàng)面大體外觀及組織學。勾畫創(chuàng)面床、創(chuàng)緣及鄰近正常皮膚。比例尺:250 μm。
c. m6A-DB分析從創(chuàng)面邊緣皮膚和鄰近正常皮膚提取mRNA的整體m6A水平。亞甲基藍(Methylene blue)染色法檢測總RNA(作為loading control)。實驗重復三次。t檢驗，雙側(cè)*P<0.05。
d.創(chuàng)面邊緣和正常皮膚m6A“writer”和“eraser”基因表達的熱圖。實驗設(shè)4個生物重復。
e.RNA-seq數(shù)據(jù)(GSE159939)繪制的m6A“writer”和“eraser”基因在創(chuàng)床和創(chuàng)緣表皮和真皮中的表達熱圖。
f. IF檢測創(chuàng)緣皮膚ALKBH5表達。比例尺:100 μm。
g.統(tǒng)計分析每個HPF中ALKBH5角質(zhì)形成細胞的百分比。取4只小鼠創(chuàng)面樣本，ALKBH5細胞百分比以均數(shù)±SD表示。t檢驗，雙側(cè)***P<0.001。
h.代表性臨床照片，顯示了一組以愈合或難治性不愈合創(chuàng)面為特征的慢性創(chuàng)面患者隊列。
i. IF檢測愈合創(chuàng)面、難愈創(chuàng)面及正常皮膚創(chuàng)面邊緣ALKBH5的表達。比例尺:100 μm。
j.統(tǒng)計分析每個HPF中ALKBH5表皮細胞的百分比。分析4例愈合創(chuàng)面、6例難愈創(chuàng)面的創(chuàng)緣及相應的正常皮膚對照。ALKBH5細胞的百分比表示為平均值±SD。單因素方差分析，***P < 0.001。Epi表皮。虛線表示表皮邊界++++
（2）ALKBH5抑制降低角質(zhì)形成細胞的遷移
c. 從ALKBH5敲低組和對照組的HaCaT細胞中提取RNA，通過m6A-DB檢測siRNA轉(zhuǎn)染后的整體m6A水平。亞甲基藍染色法檢測總RNA(作為對照)。
d. Transwell實驗分析ALKBH5敲低組和對照組HaCaT細胞的遷移能力。比例尺:25 μm。
e. Transwell實驗的統(tǒng)計分析。所有實驗重復3次，共納入5個隨機字段進行分析。遷移細胞面積的百分比用平均值±SD表示。單因素方差分析，***P < 0.001。
f. 采用細胞跟蹤成像技術(shù)繪制ALKBH5敲低或?qū)φ誋aCaT細胞劃痕實驗后0 h、2 h、16 h、32 h的代表性動態(tài)細胞速度圖。x方向速度為u, y方向速度為v。速度大小表示u和v的合成速度，速度的方向和大小分別用黑色箭頭和顏色密度表示。FC相位對比圖像。比例尺:250 μm。
g. 不同時間點ALKBH5敲低組和對照組HaCaT細胞的速度大小的統(tǒng)計分析。
h. 統(tǒng)計分析劃痕創(chuàng)面愈合率。所有實驗重復三次。
i. 通過劃痕實驗評估HaCaT細胞的長期遷移能力。比例尺:100 μm。
j. 創(chuàng)面愈合實驗的統(tǒng)計學分析。所有實驗重復3次，每個時間點納入3個隨機字段進行分析。單因素方差分析，***P < 0.001
（3）ALKBH5敲除可抑制小鼠創(chuàng)面再上皮化
b-c. WB (b)和IF (c)分別證實ALKBH5-/-小鼠皮膚和表皮中ALKBH5表達缺失。
d. m6A-DB分析WT和ALKBH5-/-小鼠創(chuàng)面邊緣皮膚的整體m6A水平。亞甲基藍染色法檢測總RNA(作為裝載對照)。實驗重復三次，m6A修飾的相對含量以平均值±SD表示。t檢驗，雙側(cè)*P<0.05。
e. IF分析揭示ALKBH5 -/-小鼠創(chuàng)面邊緣表皮中ALKBH5表達缺失。比例尺:100 μm。虛線表示表皮邊界。Epi表皮。
f-g. WT和ALKBH5-/-小鼠在PWD0、PWD2、PWD4、PWD6、PWD8上的皮膚創(chuàng)面代表性圖像(f)。比例尺:2 mm。黑色虛線圓描繪了5mm寬的原始創(chuàng)面。創(chuàng)面閉合率(g)通過ImageJ軟件進行量化，并表示為不愈合區(qū)域的百分比。6只小鼠的12個創(chuàng)面納入分析。創(chuàng)面閉合的相對百分比以平均值±SD表示。t檢驗，雙側(cè)**P<0.01， ***P<0.001。
h-i. PWD8時WT和ALKBH5-/-小鼠創(chuàng)面再上皮化的組織學分析(h)。箭頭線表示原創(chuàng)面間隙寬度為5 mm。鈍端線描繪上皮間隙，代表非上皮化的創(chuàng)面區(qū)域。比例尺:1mm。在PWD8時對WT和ALKBH5-/-小鼠的再上皮化百分比進行定量分析(i)。6只小鼠的12個創(chuàng)面納入分析。再上皮化創(chuàng)面面積的相對百分比以均數(shù)±SD表示。Mann-Whitney檢驗，雙側(cè)****P< 0.0001。比例尺:1mm。虛線表示表皮邊界
（4）全基因組MeRIP-seq和RNA-seq鑒定出PELI2是ALKBH5的下游靶標
圖4：在人表皮樣本和角質(zhì)形成細胞系中受ALKBH5調(diào)控的m6A修飾基因表征
a. m6A修飾下游分析流程圖。MeRIP-seq鑒定出人類表皮樣本和角質(zhì)形成細胞系共有的3710個基因，在3'UTR中具有特異性m6A peaks。RNA-seq在 ALKBH5敲低后鑒定出306個下調(diào)基因；以|FC|<0.5和P <0.05定義為差異表達基因。FC fold change。最終鑒定出16個同時具有m6A peaks和差異表達候選基因作為ALKBH5的潛在下游靶點。
b. 3710個共有基因的GO富集分析圖譜。
c. 由IPA產(chǎn)生的PELI2和其他15個候選基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。未顯示C3orf33、PGBD2、ZNF20、ZNF573、ZNF577和ZNF785基因，因為它們與PELI2沒有通路連接。
d. qRT-PCR檢測ALKBH5敲低后16個候選基因的表達。實驗重復3次，mRNA的相對表達量以平均值±SD表示。單因素方差分析，*P<0.05;** p<0.01。
e. IGV軌跡顯示人表皮和HaCaT中PELI2的MeRIP-seq reads覆蓋。
f. m6A-RIP-qPCR檢測證實PELI2轉(zhuǎn)錄本的m6A修飾。實驗重復三次。將抗m6A抗體組和IgG組的mRNA相對表達量進行比較，以均數(shù)±SD表示。單因素方差分析，**P<0.01
(5) ALKBH5調(diào)控m6A甲基化和PELI2表達
b. WB敲低ALKBH5后，檢測HaCaT細胞PELI2蛋白表達。
c. 通過IF染色分析PWD8中的WT和ALKBH5-/-小鼠創(chuàng)緣皮膚PELI2表達。虛線表示表皮邊界。比例尺:100 μm。
d. qRT-PCR顯示PELI2在WT和ALKBH5-/-小鼠原代角質(zhì)形成細胞中的mRNA表達。實驗重復3次，mRNA相對表達量以平均值±SD表示。t檢驗，雙側(cè)**P<0.01。
e. 采用IF染色分析PWD6時WT小鼠創(chuàng)緣表皮PELI2和ALKBH5的表達及共定位情況。比例尺:100 μm。
f. IGV軌跡顯示ALKBH5敲低后PELI2的MeRIP-seq reads覆蓋情況。實驗設(shè)置2個重復。
g. 通過基因特異性m6A-RIP-qPCR檢測HACAT細胞中ALKBH5敲低后PELI2轉(zhuǎn)錄本的m6A修飾增加。實驗重復3次，將每組mRNA的相對表達量與input值進行比較，以平均值±SD表示。單因素方差分析，ns不顯著，*P<0.05，****P<0.0001
（6）外源性PELI2過表達可挽救ALKBH5缺失后延遲的創(chuàng)面再上皮化
c. WB檢測ALKBH5和PELI2的蛋白表達。
d. Transwell實驗顯示外源性PELI2過表達對ALKBH5敲低或?qū)φ誋aCaT細胞遷移的影響。比例尺:25 μm。
e. 對Transwell實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。所有實驗重復3次，共納入5個隨機字段進行分析。遷移細胞的百分比面積表示為平均值±SD。單因素方差分析，***P<0.001。比例尺:25 μm。
f. 采用劃痕實驗評估外源性PELI2過表達對ALKBH5敲低或?qū)φ誋aCaT細胞遷移的影響。比例尺:100 μm。
g.創(chuàng)面劃痕實驗的統(tǒng)計學分析。所有實驗重復3次，每個時間點的3個隨機字段納入分析。Mann-Whitney檢驗(24 h)， ALKBH5-si1 + p-PELI2組與ALKBH5-si1 + p-NC組、ALKBH5-si2 + p-PELI2組與ALKBH5-si2 + p-NC組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。單因素方差分析(48 h, 72 h)，***P<0.001
b. qRT-PCR證實ALKBH5-/-小鼠創(chuàng)緣皮膚PELI2 mRNA表達恢復。5只小鼠的5個創(chuàng)面納入分析�；虻南鄬Ρ磉_水平以平均值±SD表示。單因素方差分析，*P<0.05，**P<0.01。
c. IF分析證實Lv-PELI2轉(zhuǎn)染后ALKBH5-/-小鼠創(chuàng)緣表皮PELI2表達恢復。虛線表示表皮邊界。Epi表皮。比例尺:25 μm。
d-e. Lv-NC轉(zhuǎn)染的WT小鼠以及Lv-PELI2或Lv-NC轉(zhuǎn)染的ALKBH5-/-小鼠在PWD0、PWD2、PWD4、PWD6、PWD8的皮膚創(chuàng)面代表性圖像。比例尺:2mm。黑色虛線圓圈繪制了5 mm寬的原始創(chuàng)面。采用ImageJ軟件對創(chuàng)面閉合率(e)進行量化，e表示為創(chuàng)面未愈合面積的百分比。5只小鼠的10個創(chuàng)面納入分析。創(chuàng)面閉合的相對百分比以平均值±SD表示。單因素方差分析(第2天，第4天，第6天)，***P < 0.001。Mann-Whitney檢驗(第8天)，雙側(cè)*P< 0.05 (KO + Lv-PELI2 vs. KO + Lv-NC)。
f-g. 用Lv-NC轉(zhuǎn)染的WT小鼠和用Lv-PELI2或Lv-NC轉(zhuǎn)染的ALKBH5-/-小鼠在劃痕實驗后第8天的創(chuàng)面再上皮化組織學分析(f)。箭頭線表示原創(chuàng)面間隙寬度為5mm。鈍端線描繪了上皮間隙，表示非上皮化創(chuàng)面寬度。再上皮化百分比定量(g)。5只小鼠的10個創(chuàng)面納入分析。再上皮化創(chuàng)面的相對百分比以均數(shù)±SD表示。Mann-Whitney檢驗，雙側(cè)**P<0.01,****P<0.0001。虛線表示表皮邊界。比例尺:200 μm
（7）ALKBH5以YTHDF2依賴性方式穩(wěn)定PELI2 mRNA表達
b. 用于RNA下拉分析的RNA探針示意圖。
c. 使用帶有或不帶有m6A修飾的PELI2 RNA探針，從細胞提取物中RNA下拉內(nèi)源性YTHDF2蛋白。實驗設(shè)置3個重復。
d-e. 通過qRT-PCR (d)和WB (e)評估ALKBH5和YTHDF2敲低組或?qū)φ战MHaCaT細胞中的PELI2表達。實驗進行3個重復。對PELI2的mRNA相對表達水平進行定量分析，并以平均值±SD表示。單因素方差分析，*P<0.05，**P<0.01。
f. 用放線菌素D (5 μg/mL)處理ALKBH5和YTHDF2敲除或?qū)φ誋aCaT細胞0h、2 h、4 h、6 h、8 h， qRT-PCR分析PELI2的mRNA表達。實驗重復三次。
g. m6A eraser蛋白ALKBH5上調(diào)介導m6A甲基化降低如何通過YTHDF2依賴性方式增強PELI2 mRNA的穩(wěn)定性來促進創(chuàng)面再上皮化示意圖
研究結(jié)論
本研究通過MeRIP-seq和對應的RNA-seq等分析揭示了創(chuàng)面再上皮化的一種新機制，通過該機制，m6A eraser蛋白ALKBH5在創(chuàng)緣被特異性激活，并通過從PELI2 mRNA中去除m6A位點并保護其免受YTHDF2介導的降解來促進角質(zhì)形成細胞遷移。本研究從RNA表觀轉(zhuǎn)錄組調(diào)控角度拓展了對創(chuàng)面再上皮化的理解。重要的是，ALKBH5和PELI2可能是開發(fā)針對難愈性創(chuàng)面患者的重編程m6A靶向治療的潛在治療靶點。
參考文獻：
Huang X, Zhao Y, Liu D, Gu S, Liu Y, Khoong Y, Luo S, Zhang Z, Xia W, Wang M, Liang H, Li M, Li Q, Zan T. ALKBH5-mediated m6A demethylation fuels cutaneous wound re-epithelialization by enhancing PELI2 mRNA stability. Inflamm Regen. 2023 Jul 14;43(1):36.
N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物中最普遍的內(nèi)部mRNA修飾，哺乳動物m6A修飾受“writers”（如METTL3、METTL14、WTAP）和“erasers”（如FTO、ALKBH5））的動態(tài)和可逆調(diào)控。同時m6A修飾可以被特異性RNA結(jié)合蛋白識別（稱為“readers”，如YTHDF1-3、HNRNP、IGF2BP）。m6A修飾被“readers”蛋白識別后，可以影響RNA代謝的各個方面，包括RNA穩(wěn)定性、翻譯、剪接、易位和高級結(jié)構(gòu)。近年來大量研究表明m6A修飾廣泛參與毛囊形態(tài)發(fā)生、紫外線介導的皮膚損傷、系統(tǒng)性硬化、尋常型銀屑病、增生性瘢痕和腫瘤發(fā)生的調(diào)控。同時，m6A修飾在創(chuàng)面愈合過程中也發(fā)揮著重要作用，然而m6A修飾是否在調(diào)控角質(zhì)形成細胞的遷移能力中發(fā)揮作用仍不清楚。此外對m6A修飾在創(chuàng)面再上皮化中的作用缺乏全面了解。
2023年7月14日，上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復外科Xin Huang、Yixuan Zhao、湖南中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院創(chuàng)面修復科劉代明為共同第一作者，上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復外科昝濤、李青峰、Yixuan Zhao為共同通訊作者， 以“ALKBH5-mediated m6A demethylation fuels cutaneous wound re-epithelialization by enhancing PELI2 mRNA stability”為題在《Inflammation and Regeneration》雜志發(fā)表研究論文，該研究通過甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）和對應的RNA-seq聯(lián)合分析揭示了ALKBH5是創(chuàng)面再上皮化的內(nèi)源性促進因子，提示了開發(fā)針對難治性創(chuàng)面的重編程m6A靶向療法的前景。
時間：2023-07-14
期刊：Inflammation and Regeneration
影響因子：IF 8.1
技術(shù)平臺：m6A-seq（MeRIP-seq）、RNA-seq、m6A-RIP-qPCR 、qRT-PCR、Dot-blot、WB/IF等
研究摘要：
創(chuàng)面再上皮化受損會導致皮膚屏障重建功能障礙。m6A RNA修飾參與RNA命運決定，m6A甲基化變異會觸發(fā)許多疾病發(fā)病機制。然而，m6A在創(chuàng)面再上皮化中的作用仍然未知。本研究構(gòu)建ALKBH5-/-小鼠以研究ALKBH5敲除后創(chuàng)面再上皮化率。采用甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）和RNA-seq結(jié)合的高通量測序分析方法鑒定出ALKBH5的下游靶標。通過體外和體內(nèi)挽救實驗（In vitro and in vivo rescue experiments）驗證下游靶標對ALKBH5缺失細胞或動物的功能表型作用。此外，通過RIP-qPCR、RNA下拉和RNA穩(wěn)定性分析揭示了互作的reader蛋白和調(diào)控機制。
研究結(jié)果表明，ALKBH5在創(chuàng)緣表皮中特異性上調(diào)。ALKBH5敲除抑制了ALKBH5-/-小鼠的角質(zhì)形成細胞（keratinocytes）遷移，并導致創(chuàng)面再上皮化延遲。綜合高通量分析揭示E3泛素蛋白連接酶PELI2是ALKBH5的下游靶標。體外和體內(nèi)挽救實驗結(jié)果表明，外源性PELI2補充可以在體內(nèi)和體外部分挽救ALKBH5缺失細胞中的角質(zhì)形成細胞遷移并加速再上皮化。從機制上來說，ALKBH5通過去除PELI2 mRNA中的m6A修飾來促進PELI2表達，并以YTHDF2依賴的方式增強其穩(wěn)定性。
圖形摘要
研究結(jié)果
（1）在創(chuàng)緣的角質(zhì)形成細胞（keratinocytes）中觀察到RNA m6A修飾減少和ALKBH5表達增加
圖1：健康創(chuàng)面邊緣角質(zhì)形成細胞中RNA m6A修飾降低，ALKBH5表達增加。
b. 傷后2 d (PWD2)皮膚創(chuàng)面大體外觀及組織學。勾畫創(chuàng)面床、創(chuàng)緣及鄰近正常皮膚。比例尺:250 μm。
c. m6A-DB分析從創(chuàng)面邊緣皮膚和鄰近正常皮膚提取mRNA的整體m6A水平。亞甲基藍(Methylene blue)染色法檢測總RNA(作為loading control)。實驗重復三次。t檢驗，雙側(cè)*P<0.05。
d.創(chuàng)面邊緣和正常皮膚m6A“writer”和“eraser”基因表達的熱圖。實驗設(shè)4個生物重復。
e.RNA-seq數(shù)據(jù)(GSE159939)繪制的m6A“writer”和“eraser”基因在創(chuàng)床和創(chuàng)緣表皮和真皮中的表達熱圖。
f. IF檢測創(chuàng)緣皮膚ALKBH5表達。比例尺:100 μm。
g.統(tǒng)計分析每個HPF中ALKBH5角質(zhì)形成細胞的百分比。取4只小鼠創(chuàng)面樣本，ALKBH5細胞百分比以均數(shù)±SD表示。t檢驗，雙側(cè)***P<0.001。
h.代表性臨床照片，顯示了一組以愈合或難治性不愈合創(chuàng)面為特征的慢性創(chuàng)面患者隊列。
i. IF檢測愈合創(chuàng)面、難愈創(chuàng)面及正常皮膚創(chuàng)面邊緣ALKBH5的表達。比例尺:100 μm。
j.統(tǒng)計分析每個HPF中ALKBH5表皮細胞的百分比。分析4例愈合創(chuàng)面、6例難愈創(chuàng)面的創(chuàng)緣及相應的正常皮膚對照。ALKBH5細胞的百分比表示為平均值±SD。單因素方差分析，***P < 0.001。Epi表皮。虛線表示表皮邊界++++
（2）ALKBH5抑制降低角質(zhì)形成細胞的遷移
圖2：抑制ALKBH5可在體外破壞角質(zhì)形成細胞遷移。
a-b. 通過qRT-PCR (a)和WB (b)驗證，siRNA轉(zhuǎn)染后，HaCaT細胞中的ALKBH5表達降低。實驗重復3次。單因素方差分析 ***P < 0.001。c. 從ALKBH5敲低組和對照組的HaCaT細胞中提取RNA，通過m6A-DB檢測siRNA轉(zhuǎn)染后的整體m6A水平。亞甲基藍染色法檢測總RNA(作為對照)。
d. Transwell實驗分析ALKBH5敲低組和對照組HaCaT細胞的遷移能力。比例尺:25 μm。
e. Transwell實驗的統(tǒng)計分析。所有實驗重復3次，共納入5個隨機字段進行分析。遷移細胞面積的百分比用平均值±SD表示。單因素方差分析，***P < 0.001。
f. 采用細胞跟蹤成像技術(shù)繪制ALKBH5敲低或?qū)φ誋aCaT細胞劃痕實驗后0 h、2 h、16 h、32 h的代表性動態(tài)細胞速度圖。x方向速度為u, y方向速度為v。速度大小表示u和v的合成速度，速度的方向和大小分別用黑色箭頭和顏色密度表示。FC相位對比圖像。比例尺:250 μm。
g. 不同時間點ALKBH5敲低組和對照組HaCaT細胞的速度大小的統(tǒng)計分析。
h. 統(tǒng)計分析劃痕創(chuàng)面愈合率。所有實驗重復三次。
i. 通過劃痕實驗評估HaCaT細胞的長期遷移能力。比例尺:100 μm。
j. 創(chuàng)面愈合實驗的統(tǒng)計學分析。所有實驗重復3次，每個時間點納入3個隨機字段進行分析。單因素方差分析，***P < 0.001
（3）ALKBH5敲除可抑制小鼠創(chuàng)面再上皮化
圖3：ALKBH5缺失會抑制小鼠創(chuàng)面的再上皮化。
a .使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除ALKBH5基因的策略示意圖。b-c. WB (b)和IF (c)分別證實ALKBH5-/-小鼠皮膚和表皮中ALKBH5表達缺失。
d. m6A-DB分析WT和ALKBH5-/-小鼠創(chuàng)面邊緣皮膚的整體m6A水平。亞甲基藍染色法檢測總RNA(作為裝載對照)。實驗重復三次，m6A修飾的相對含量以平均值±SD表示。t檢驗，雙側(cè)*P<0.05。
e. IF分析揭示ALKBH5 -/-小鼠創(chuàng)面邊緣表皮中ALKBH5表達缺失。比例尺:100 μm。虛線表示表皮邊界。Epi表皮。
f-g. WT和ALKBH5-/-小鼠在PWD0、PWD2、PWD4、PWD6、PWD8上的皮膚創(chuàng)面代表性圖像(f)。比例尺:2 mm。黑色虛線圓描繪了5mm寬的原始創(chuàng)面。創(chuàng)面閉合率(g)通過ImageJ軟件進行量化，并表示為不愈合區(qū)域的百分比。6只小鼠的12個創(chuàng)面納入分析。創(chuàng)面閉合的相對百分比以平均值±SD表示。t檢驗，雙側(cè)**P<0.01， ***P<0.001。
h-i. PWD8時WT和ALKBH5-/-小鼠創(chuàng)面再上皮化的組織學分析(h)。箭頭線表示原創(chuàng)面間隙寬度為5 mm。鈍端線描繪上皮間隙，代表非上皮化的創(chuàng)面區(qū)域。比例尺:1mm。在PWD8時對WT和ALKBH5-/-小鼠的再上皮化百分比進行定量分析(i)。6只小鼠的12個創(chuàng)面納入分析。再上皮化創(chuàng)面面積的相對百分比以均數(shù)±SD表示。Mann-Whitney檢驗，雙側(cè)****P< 0.0001。比例尺:1mm。虛線表示表皮邊界
（4）全基因組MeRIP-seq和RNA-seq鑒定出PELI2是ALKBH5的下游靶標
圖4：在人表皮樣本和角質(zhì)形成細胞系中受ALKBH5調(diào)控的m6A修飾基因表征
b. 3710個共有基因的GO富集分析圖譜。
c. 由IPA產(chǎn)生的PELI2和其他15個候選基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。未顯示C3orf33、PGBD2、ZNF20、ZNF573、ZNF577和ZNF785基因，因為它們與PELI2沒有通路連接。
d. qRT-PCR檢測ALKBH5敲低后16個候選基因的表達。實驗重復3次，mRNA的相對表達量以平均值±SD表示。單因素方差分析，*P<0.05;** p<0.01。
e. IGV軌跡顯示人表皮和HaCaT中PELI2的MeRIP-seq reads覆蓋。
f. m6A-RIP-qPCR檢測證實PELI2轉(zhuǎn)錄本的m6A修飾。實驗重復三次。將抗m6A抗體組和IgG組的mRNA相對表達量進行比較，以均數(shù)±SD表示。單因素方差分析，**P<0.01
(5) ALKBH5調(diào)控m6A甲基化和PELI2表達
圖5：ALKBH5表達水平與PELI2表達水平呈正相關(guān)。
a. 根據(jù)ALKBH5敲低或?qū)φ誋aCaT細胞的RNA-seq分析，IGV追蹤PELI2表達。實驗設(shè)置兩個重復。b. WB敲低ALKBH5后，檢測HaCaT細胞PELI2蛋白表達。
c. 通過IF染色分析PWD8中的WT和ALKBH5-/-小鼠創(chuàng)緣皮膚PELI2表達。虛線表示表皮邊界。比例尺:100 μm。
d. qRT-PCR顯示PELI2在WT和ALKBH5-/-小鼠原代角質(zhì)形成細胞中的mRNA表達。實驗重復3次，mRNA相對表達量以平均值±SD表示。t檢驗，雙側(cè)**P<0.01。
e. 采用IF染色分析PWD6時WT小鼠創(chuàng)緣表皮PELI2和ALKBH5的表達及共定位情況。比例尺:100 μm。
f. IGV軌跡顯示ALKBH5敲低后PELI2的MeRIP-seq reads覆蓋情況。實驗設(shè)置2個重復。
g. 通過基因特異性m6A-RIP-qPCR檢測HACAT細胞中ALKBH5敲低后PELI2轉(zhuǎn)錄本的m6A修飾增加。實驗重復3次，將每組mRNA的相對表達量與input值進行比較，以平均值±SD表示。單因素方差分析，ns不顯著，*P<0.05，****P<0.0001
（6）外源性PELI2過表達可挽救ALKBH5缺失后延遲的創(chuàng)面再上皮化
圖6：外源性PELI2過表達挽救了ALKBH5敲低對角質(zhì)形成細胞遷移的影響。
a-b. qRT-PCR顯示在用ALKBH5或NC siRNA處理并用PELI2或NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h后的HaCaT細胞中PELI2（a）和ALKBH5（b）的mRNA表達。實驗重復3次，mRNA的相對表達量以平均值±SD表示。單因素方差分析，ns不顯著，*P<0.05，****P<0.0001。c. WB檢測ALKBH5和PELI2的蛋白表達。
d. Transwell實驗顯示外源性PELI2過表達對ALKBH5敲低或?qū)φ誋aCaT細胞遷移的影響。比例尺:25 μm。
e. 對Transwell實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。所有實驗重復3次，共納入5個隨機字段進行分析。遷移細胞的百分比面積表示為平均值±SD。單因素方差分析，***P<0.001。比例尺:25 μm。
f. 采用劃痕實驗評估外源性PELI2過表達對ALKBH5敲低或?qū)φ誋aCaT細胞遷移的影響。比例尺:100 μm。
g.創(chuàng)面劃痕實驗的統(tǒng)計學分析。所有實驗重復3次，每個時間點的3個隨機字段納入分析。Mann-Whitney檢驗(24 h)， ALKBH5-si1 + p-PELI2組與ALKBH5-si1 + p-NC組、ALKBH5-si2 + p-PELI2組與ALKBH5-si2 + p-NC組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。單因素方差分析(48 h, 72 h)，***P<0.001
圖7：外源性PELI2過表達挽救了ALKBH5敲低對再上皮化和創(chuàng)面愈合的影響。
a. 創(chuàng)面建立后d0和d1, WT和ALKBH5-/-小鼠創(chuàng)緣皮膚皮內(nèi)注射Lv-PELI2和Lv-NC (1×107 TU/ml, 1% Lipo3000)示意圖。于PWD8時處死小鼠。b. qRT-PCR證實ALKBH5-/-小鼠創(chuàng)緣皮膚PELI2 mRNA表達恢復。5只小鼠的5個創(chuàng)面納入分析�；虻南鄬Ρ磉_水平以平均值±SD表示。單因素方差分析，*P<0.05，**P<0.01。
c. IF分析證實Lv-PELI2轉(zhuǎn)染后ALKBH5-/-小鼠創(chuàng)緣表皮PELI2表達恢復。虛線表示表皮邊界。Epi表皮。比例尺:25 μm。
d-e. Lv-NC轉(zhuǎn)染的WT小鼠以及Lv-PELI2或Lv-NC轉(zhuǎn)染的ALKBH5-/-小鼠在PWD0、PWD2、PWD4、PWD6、PWD8的皮膚創(chuàng)面代表性圖像。比例尺:2mm。黑色虛線圓圈繪制了5 mm寬的原始創(chuàng)面。采用ImageJ軟件對創(chuàng)面閉合率(e)進行量化，e表示為創(chuàng)面未愈合面積的百分比。5只小鼠的10個創(chuàng)面納入分析。創(chuàng)面閉合的相對百分比以平均值±SD表示。單因素方差分析(第2天，第4天，第6天)，***P < 0.001。Mann-Whitney檢驗(第8天)，雙側(cè)*P< 0.05 (KO + Lv-PELI2 vs. KO + Lv-NC)。
f-g. 用Lv-NC轉(zhuǎn)染的WT小鼠和用Lv-PELI2或Lv-NC轉(zhuǎn)染的ALKBH5-/-小鼠在劃痕實驗后第8天的創(chuàng)面再上皮化組織學分析(f)。箭頭線表示原創(chuàng)面間隙寬度為5mm。鈍端線描繪了上皮間隙，表示非上皮化創(chuàng)面寬度。再上皮化百分比定量(g)。5只小鼠的10個創(chuàng)面納入分析。再上皮化創(chuàng)面的相對百分比以均數(shù)±SD表示。Mann-Whitney檢驗，雙側(cè)**P<0.01,****P<0.0001。虛線表示表皮邊界。比例尺:200 μm
（7）ALKBH5以YTHDF2依賴性方式穩(wěn)定PELI2 mRNA表達
圖8：YTHDF2與m6A修飾結(jié)合并穩(wěn)定PELI2 mRNA。
a. RIP-qPCR分析顯示YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3在PELI2轉(zhuǎn)錄本中富集。實驗設(shè)置4個重復，mRNA的相對表達量與input值進行比較，用平均值±SD表示。單因素方差分析，****P<0.0001。b. 用于RNA下拉分析的RNA探針示意圖。
c. 使用帶有或不帶有m6A修飾的PELI2 RNA探針，從細胞提取物中RNA下拉內(nèi)源性YTHDF2蛋白。實驗設(shè)置3個重復。
d-e. 通過qRT-PCR (d)和WB (e)評估ALKBH5和YTHDF2敲低組或?qū)φ战MHaCaT細胞中的PELI2表達。實驗進行3個重復。對PELI2的mRNA相對表達水平進行定量分析，并以平均值±SD表示。單因素方差分析，*P<0.05，**P<0.01。
f. 用放線菌素D (5 μg/mL)處理ALKBH5和YTHDF2敲除或?qū)φ誋aCaT細胞0h、2 h、4 h、6 h、8 h， qRT-PCR分析PELI2的mRNA表達。實驗重復三次。
g. m6A eraser蛋白ALKBH5上調(diào)介導m6A甲基化降低如何通過YTHDF2依賴性方式增強PELI2 mRNA的穩(wěn)定性來促進創(chuàng)面再上皮化示意圖
研究結(jié)論
本研究通過MeRIP-seq和對應的RNA-seq等分析揭示了創(chuàng)面再上皮化的一種新機制，通過該機制，m6A eraser蛋白ALKBH5在創(chuàng)緣被特異性激活，并通過從PELI2 mRNA中去除m6A位點并保護其免受YTHDF2介導的降解來促進角質(zhì)形成細胞遷移。本研究從RNA表觀轉(zhuǎn)錄組調(diào)控角度拓展了對創(chuàng)面再上皮化的理解。重要的是，ALKBH5和PELI2可能是開發(fā)針對難愈性創(chuàng)面患者的重編程m6A靶向治療的潛在治療靶點。
參考文獻：
Huang X, Zhao Y, Liu D, Gu S, Liu Y, Khoong Y, Luo S, Zhang Z, Xia W, Wang M, Liang H, Li M, Li Q, Zan T. ALKBH5-mediated m6A demethylation fuels cutaneous wound re-epithelialization by enhancing PELI2 mRNA stability. Inflamm Regen. 2023 Jul 14;43(1):36.
標簽：
m6A
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